Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi sonuçlar için daha yeni bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu süre zarfında, desteğin devamını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
Modic Change (MC) hayvan modellerinin oluşturulması, MC'nin incelenmesi için önemli bir temeldir. Elli dört Yeni Zelanda Beyaz tavşanı, sham-operasyon grubu, kas implantasyon grubu (ME grubu) ve nükleus pulposus implantasyon grubu (NPE grubu) olmak üzere üç gruba ayrıldı. NPE grubunda, anterolateral lomber cerrahi yaklaşımla intervertebral disk açığa çıkarıldı ve L5 omur gövdesine uç plakasına yakın bir yerden iğne ile delik açıldı. NP, bir şırınga ile L1/2 intervertebral diskinden çıkarıldı ve içine enjekte edildi. Subkondral kemikte bir delik açıldı. Kas implantasyon grubu ve sham-operasyon grubundaki cerrahi işlemler ve delme yöntemleri, NP implantasyon grubundakilerle aynıydı. ME grubunda, deliğe bir parça kas yerleştirilirken, sham-operasyon grubunda deliğe hiçbir şey yerleştirilmedi. Ameliyattan sonra, MRI taraması ve moleküler biyolojik testler yapıldı. NPE grubunda sinyal değişti, ancak sham-operasyon grubunda ve ME grubunda belirgin bir sinyal değişikliği gözlenmedi. Histolojik gözlem, implantasyon bölgesinde anormal doku proliferasyonunun gözlendiğini ve NPE grubunda IL-4, IL-17 ve IFN-γ ekspresyonunun arttığını gösterdi. NP'nin subkondral kemiğe implantasyonu, MC'nin hayvan modelini oluşturabilir.
Modic değişiklikleri (MC), manyetik rezonans görüntülemede (MRG) görülebilen omurga uç plakları ve bitişik kemik iliğindeki lezyonlardır. İlişkili semptomları olan bireylerde oldukça yaygındır¹. Birçok çalışma, bel ağrısı (LBP) ile ilişkisi nedeniyle MC'nin önemini vurgulamıştır²⁻³. de Roos ve ark.⁴ ve Modic ve ark.⁵, omurga kemik iliğinde üç farklı subkondral sinyal anormalliği tipini ilk kez bağımsız olarak tanımlamışlardır. Modic tip I değişiklikleri, T1 ağırlıklı (T1W) sekanslarda hipointens ve T2 ağırlıklı (T2W) sekanslarda hiperintenstir. Bu lezyon, kemik iliğinde fissür uç plaklarını ve bitişik vasküler granülasyon dokusunu ortaya çıkarır. Modic tip II değişiklikleri, hem T1W hem de T2W sekanslarında yüksek sinyal gösterir. Bu lezyon tipinde, uç plak yıkımı ve bitişik kemik iliğinin histolojik yağlı değişimi bulunabilir. Modic tip III değişiklikleri, T1W ve T2W sekanslarında düşük sinyal gösterir. Uç plaklara karşılık gelen sklerotik lezyonlar gözlemlenmiştir⁶. MC, omurganın patolojik bir hastalığı olarak kabul edilir ve omurganın birçok dejeneratif hastalığıyla yakından ilişkilidir⁷,⁸,⁹.
Mevcut veriler göz önüne alındığında, çeşitli çalışmalar MC'nin etiyolojisi ve patolojik mekanizmalarına ilişkin ayrıntılı bilgiler sağlamıştır. Albert ve ark. MC'nin disk herniasyonundan kaynaklanabileceğini öne sürmüştür⁸. Hu ve ark. MC'yi şiddetli disk dejenerasyonuna bağlamıştır¹⁰. Kroc, tekrarlayan disk travmasının uç plakada mikro yırtıklara yol açabileceğini belirten "iç disk rüptürü" kavramını ortaya atmıştır. Yarık oluşumundan sonra, nükleus pulposus (NP) tarafından uç plakanın tahrip edilmesi, otoimmün bir yanıtı tetikleyebilir ve bu da MC gelişimine yol açabilir¹¹. Ma ve ark. benzer bir görüşü paylaşmış ve NP kaynaklı otoimmünitenin MC patogenezinde önemli bir rol oynadığını bildirmiştir¹².
Bağışıklık sistemi hücreleri, özellikle CD4+ T yardımcı lenfositler, otoimmünitenin patogenezinde kritik bir rol oynar13. Son zamanlarda keşfedilen Th17 alt kümesi, proinflamatuar sitokin IL-17'yi üretir, kemokin ekspresyonunu teşvik eder ve hasarlı organlardaki T hücrelerini IFN-γ üretmeye teşvik eder14. Th2 hücreleri de bağışıklık tepkilerinin patogenezinde benzersiz bir rol oynar. Temsilci bir Th2 hücresi olan IL-4'ün ekspresyonu, ciddi immünopatolojik sonuçlara yol açabilir15.
MC16,17,18,19,20,21,22,23,24 üzerine birçok klinik çalışma yapılmış olmasına rağmen, insanlarda sıklıkla görülen MC sürecini taklit edebilecek ve etiyolojiyi veya hedefli tedavi gibi yeni tedavileri araştırmak için kullanılabilecek uygun hayvan deney modelleri hala yetersizdir. Bugüne kadar, altta yatan patolojik mekanizmaları incelemek için yalnızca birkaç MC hayvan modeli rapor edilmiştir.
Albert ve Ma tarafından öne sürülen otoimmün teoriye dayanarak, bu çalışma, delinmiş omurga uç plakasının yakınına NP'nin ototransplantasyonu yoluyla basit ve tekrarlanabilir bir tavşan MC modeli oluşturmuştur. Diğer amaçlar, hayvan modellerinin histolojik özelliklerini gözlemlemek ve MC gelişiminde NP'nin spesifik mekanizmalarını değerlendirmektir. Bu amaçla, MC'nin ilerlemesini incelemek için moleküler biyoloji, MRI ve histolojik çalışmalar gibi teknikler kullanıyoruz.
Ameliyat sırasında iki tavşan kanamadan öldü, dört tavşan ise MR çekimi sırasında anestezi nedeniyle hayatını kaybetti. Geri kalan 48 tavşan hayatta kaldı ve ameliyat sonrası herhangi bir davranışsal veya nörolojik belirti göstermedi.
MR görüntüleri, farklı deliklere yerleştirilen dokunun sinyal yoğunluğunun farklı olduğunu göstermektedir. NPE grubundaki L5 omur gövdesinin sinyal yoğunluğu, yerleştirmeden 12, 16 ve 20 hafta sonra kademeli olarak değişmiştir (T1W sekansı düşük sinyal, T2W sekansı ise karışık sinyal artı düşük sinyal göstermiştir) (Şekil 1C), diğer iki gruptaki yerleştirilen parçaların MR görüntüleri ise aynı dönemde nispeten sabit kalmıştır (Şekil 1A, B).
(A) Tavşan lomber omurgasının 3 farklı zaman noktasındaki temsili ardışık MR görüntüleri. Sahte ameliyat grubunun görüntülerinde sinyal anormalliği bulunmadı. (B) ME grubundaki omur gövdesinin sinyal özellikleri sahte ameliyat grubundakilere benzer ve zaman içinde gömme bölgesinde önemli bir sinyal değişikliği gözlenmedi. (C) NPE grubunda, T1W sekansında düşük sinyal açıkça görülmekte ve T2W sekansında karışık sinyal ve düşük sinyal açıkça görülmektedir. 12. haftadan 20. haftaya kadar, T2W sekansındaki düşük sinyalleri çevreleyen seyrek yüksek sinyaller azalmaktadır.
NPE grubunda omur gövdesinin implantasyon bölgesinde belirgin kemik hiperplazisi görülebilir ve kemik hiperplazisi 12 ila 20 hafta arasında daha hızlı gerçekleşir (Şekil 2C). NPE grubunda ise modellenen omur gövdelerinde anlamlı bir değişiklik gözlenmez; Sham grubu ve ME grubu (Şekil 2C) 2A,B).
(A) İmplantasyon yapılan bölgedeki omur gövdesinin yüzeyi çok düzgündür, delik iyi iyileşir ve omur gövdesinde hiperplazi yoktur. (B) ME grubundaki implantasyon bölgesinin şekli, sahte ameliyat grubundakiyle benzerdir ve implantasyon bölgesinin görünümünde zaman içinde belirgin bir değişiklik yoktur. (C) NPE grubunda implantasyon bölgesinde kemik hiperplazisi meydana gelmiştir. Kemik hiperplazisi hızla artmış ve hatta intervertebral diskten karşı taraftaki omur gövdesine kadar uzanmıştır.
Histolojik analiz, kemik oluşumu hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlar. Şekil 3, H&E ile boyanmış ameliyat sonrası kesitlerin fotoğraflarını göstermektedir. Kontrol grubunda kondrositler iyi düzenlenmişti ve hücre çoğalması tespit edilmedi (Şekil 3A). ME grubundaki durum, kontrol grubundakine benzerdi (Şekil 3B). Bununla birlikte, NPE grubunda, implantasyon bölgesinde çok sayıda kondrosit ve NP benzeri hücrelerin çoğalması gözlemlendi (Şekil 3C);
(A) Trabeküller uç plakaya yakın görülebilir, kondrositler düzgün hücre boyutu ve şekliyle düzenli bir şekilde sıralanmıştır ve çoğalma yoktur (40 kat). (B) ME grubundaki implantasyon bölgesinin durumu, sham grubunun durumuna benzer. Trabeküller ve kondrositler görülebilir, ancak implantasyon bölgesinde belirgin bir çoğalma yoktur (40 kat). (B) Kondrositlerin ve NP benzeri hücrelerin önemli ölçüde çoğaldığı ve kondrositlerin şekil ve boyutunun düzensiz olduğu görülebilir (40 kat).
NPE ve ME gruplarının her ikisinde de interlökin 4 (IL-4) mRNA, interlökin 17 (IL-17) mRNA ve interferon γ (IFN-γ) mRNA ekspresyonu gözlemlendi. Hedef genlerin ekspresyon seviyeleri karşılaştırıldığında, NPE grubunda IL-4, IL-17 ve IFN-γ gen ekspresyonlarının ME grubu ve sham operasyon grubuna göre anlamlı derecede arttığı görüldü (Şekil 4) (P < 0,05). Sham operasyon grubuyla karşılaştırıldığında, ME grubunda IL-4, IL-17 ve IFN-γ ekspresyon seviyeleri sadece hafifçe arttı ve istatistiksel olarak anlamlı bir değişikliğe ulaşmadı (P > 0,05).
NPE grubunda IL-4, IL-17 ve IFN-γ'nin mRNA ekspresyonu, sham operasyon grubu ve ME grubuna göre anlamlı derecede daha yüksek bir eğilim göstermiştir (P < 0,05).
Buna karşılık, ME grubundaki ifade düzeylerinde anlamlı bir fark görülmedi (P>0.05).
IL-4 ve IL-17'ye karşı ticari olarak temin edilebilen antikorlar kullanılarak, değişen mRNA ekspresyon paternini doğrulamak için Western blot analizi yapıldı. Şekil 5A,B'de gösterildiği gibi, ME grubu ve sahte ameliyat grubuyla karşılaştırıldığında, NPE grubundaki IL-4 ve IL-17 protein seviyeleri anlamlı derecede artmıştır (P < 0,05). Sahte ameliyat grubuyla karşılaştırıldığında, ME grubundaki IL-4 ve IL-17 protein seviyelerinde de istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir (P > 0,05).
(A) NPE grubundaki IL-4 ve IL-17 protein düzeyleri, ME grubu ve plasebo grubundakilere göre anlamlı derecede daha yüksekti (P < 0,05). (B) Western blot histogramı.
Ameliyat sırasında elde edilen insan örneklerinin sınırlı sayıda olması nedeniyle, MC'nin patogenezi üzerine net ve ayrıntılı çalışmalar yapmak biraz zordur. Potansiyel patolojik mekanizmalarını incelemek için bir MC hayvan modeli oluşturmaya çalıştık. Aynı zamanda, NP otogrefti ile indüklenen MC'nin seyrini takip etmek için radyolojik değerlendirme, histolojik değerlendirme ve moleküler biyolojik değerlendirme kullanıldı. Sonuç olarak, NP implantasyon modeli, 12. haftadan 20. haftaya kadar sinyal yoğunluğunda kademeli bir değişime (T1W sekanslarında karışık düşük sinyal ve T2W sekanslarında düşük sinyal) yol açarak doku değişikliklerini gösterdi ve histolojik ve moleküler biyolojik değerlendirmeler radyolojik çalışmanın sonuçlarını doğruladı.
Bu deneyin sonuçları, NPE grubunda omur gövdesi hasarı bölgesinde görsel ve histolojik değişikliklerin meydana geldiğini göstermektedir. Aynı zamanda, IL-4, IL-17 ve IFN-γ genlerinin yanı sıra IL-4, IL-17 ve IFN-γ ekspresyonu da gözlemlenmiştir; bu da omur gövdesindeki otolog nükleus pulposus dokusunun hasarının bir dizi sinyal ve morfolojik değişikliğe neden olabileceğini göstermektedir. Hayvan modelinin omur gövdelerinin sinyal özelliklerinin (T1W sekansında düşük sinyal, T2W sekansında karışık sinyal ve düşük sinyal) insan omur hücrelerinin özelliklerine çok benzediği ve MRI özelliklerinin de histoloji ve makro anatomi gözlemlerini doğruladığı, yani omur gövdesi hücrelerindeki değişikliklerin ilerleyici olduğu kolayca görülebilir. Akut travmanın neden olduğu inflamatuar yanıt, ponksiyondan kısa bir süre sonra ortaya çıkabilse de, MRI sonuçları, ponksiyondan 12 hafta sonra giderek artan sinyal değişikliklerinin ortaya çıktığını ve MRI değişikliklerinde herhangi bir iyileşme veya geri dönüş belirtisi olmaksızın 20 haftaya kadar devam ettiğini göstermiştir. Bu sonuçlar, otolog vertebral NP'nin tavşanlarda ilerleyici MV oluşturmak için güvenilir bir yöntem olduğunu düşündürmektedir.
Bu delme modeli yeterli beceri, zaman ve cerrahi çaba gerektirir. Ön deneylerde, paravertebral ligamentöz yapıların diseksiyonu veya aşırı uyarılması, vertebral osteofit oluşumuna neden olabilir. Komşu disklerin hasar görmemesine veya tahriş edilmemesine dikkat edilmelidir. Tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için penetrasyon derinliğinin kontrol edilmesi gerektiğinden, 3 mm uzunluğundaki bir iğnenin kılıfını keserek manuel olarak bir tıkaç oluşturduk. Bu tıkaç, vertebra gövdesinde düzgün bir delme derinliği sağlar. Ön deneylerde, ameliyata katılan üç ortopedi cerrahı, 16 gauge iğnelerin 18 gauge iğnelere veya diğer yöntemlere göre daha kolay kullanıldığını bulmuştur. Delme sırasında aşırı kanamayı önlemek için, iğneyi bir süre sabit tutmak daha uygun bir giriş deliği sağlayacaktır; bu da belirli bir derecede MC'nin bu şekilde kontrol edilebileceğini düşündürmektedir.
Birçok çalışma MC'yi hedef almasına rağmen, MC'nin etiyolojisi ve patogenezi hakkında çok az şey bilinmektedir25,26,27. Önceki çalışmalarımıza dayanarak, otoimmünitenin MC'nin oluşumunda ve gelişiminde önemli bir rol oynadığını bulduk12. Bu çalışma, antijen uyarımından sonra CD4+ hücrelerinin ana farklılaşma yolları olan IL-4, IL-17 ve IFN-γ'nin kantitatif ekspresyonunu inceledi. Çalışmamızda, negatif grupla karşılaştırıldığında, NPE grubunda IL-4, IL-17 ve IFN-γ'nin ekspresyonu daha yüksekti ve IL-4 ve IL-17'nin protein seviyeleri de daha yüksekti.
Klinik olarak, disk herniasyonu olan hastalardan alınan NP hücrelerinde IL-17 mRNA ekspresyonu artmıştır28. Sağlıklı kontrollere kıyasla akut kompresyonsuz disk herniasyonu modelinde de artmış IL-4 ve IFN-γ ekspresyon seviyeleri bulunmuştur29. IL-17, otoimmün hastalıklarda inflamasyon ve doku hasarında önemli bir rol oynar30 ve IFN-γ'ye karşı bağışıklık yanıtını artırır31. MRL/lpr farelerinde32 ve otoimmüniteye yatkın farelerde33 IL-17 aracılı doku hasarının arttığı bildirilmiştir. IL-4, proinflamatuar sitokinlerin (IL-1β ve TNFα gibi) ekspresyonunu ve makrofaj aktivasyonunu inhibe edebilir34. NPE grubunda IL-4 mRNA ekspresyonunun aynı zaman noktasında IL-17 ve IFN-γ'ye göre farklı olduğu bildirilmiştir; NPE grubunda IFN-γ mRNA ekspresyonu diğer gruplara göre anlamlı derecede daha yüksektir. Bu nedenle, IFN-γ üretimi, NP interkalasyonunun neden olduğu inflamatuar yanıtın bir aracısı olabilir. Çalışmalar, IFN-γ'nin aktif tip 1 yardımcı T hücreleri, doğal öldürücü hücreler ve makrofajlar dahil olmak üzere birden fazla hücre tipi tarafından üretildiğini ve bağışıklık yanıtlarını destekleyen önemli bir pro-inflamatuar sitokin olduğunu göstermiştir35,36,37.
Bu çalışma, otoimmün yanıtın MC'nin oluşumunda ve gelişiminde rol oynayabileceğini öne sürmektedir. Luoma ve ark. MC ve belirgin NP'nin sinyal özelliklerinin MRI'da benzer olduğunu ve her ikisinin de T2W sekansında yüksek sinyal gösterdiğini bulmuşlardır.38 Bazı sitokinlerin, IL-139 gibi, MC'nin oluşumuyla yakından ilişkili olduğu doğrulanmıştır. Ma ve ark., NP'nin yukarı veya aşağı doğru çıkıntısının MC'nin oluşumu ve gelişimi üzerinde büyük bir etkiye sahip olabileceğini öne sürmüşlerdir.12 Bobechko40 ve Herzbein ve ark.41, NP'nin doğumdan itibaren vasküler dolaşıma giremeyen immünotoleranslı bir doku olduğunu bildirmişlerdir. NP çıkıntıları, kan dolaşımına yabancı cisimler sokarak lokal otoimmün reaksiyonlara aracılık eder.42 Otoimmün reaksiyonlar çok sayıda immün faktörü tetikleyebilir ve bu faktörler dokulara sürekli olarak maruz kaldığında sinyallemede değişikliklere neden olabilir.43 Bu çalışmada, IL-4, IL-17 ve IFN-γ'nin aşırı ekspresyonu tipik bağışıklık faktörleridir ve NP ile MC'ler arasındaki yakın ilişkiyi daha da kanıtlamaktadır44. Bu hayvan modeli, NP'nin atılımını ve uç plakaya girişini iyi bir şekilde taklit etmektedir. Bu süreç, otoimmünitenin MC üzerindeki etkisini daha da ortaya koymaktadır.
Beklendiği gibi, bu hayvan modeli bize MC'yi incelemek için olası bir platform sağlıyor. Bununla birlikte, bu modelin hala bazı sınırlamaları var: Birincisi, hayvan gözlem aşamasında, bazı ara evre tavşanların histolojik ve moleküler biyoloji testleri için ötenazi edilmesi gerekiyor, bu nedenle bazı hayvanlar zamanla "kullanım dışı kalıyor". İkincisi, bu çalışmada üç zaman noktası belirlenmiş olmasına rağmen, ne yazık ki sadece bir tip MC'yi (Modic tip I değişikliği) modelledik, bu nedenle insan hastalığının gelişim sürecini temsil etmek için yeterli değil ve tüm sinyal değişikliklerini daha iyi gözlemlemek için daha fazla zaman noktası belirlenmesi gerekiyor. Üçüncüsü, doku yapısındaki değişiklikler histolojik boyama ile açıkça gösterilebiliyor, ancak bazı özel teknikler bu modeldeki mikro yapısal değişiklikleri daha iyi ortaya çıkarabiliyor. Örneğin, tavşan intervertebral disklerinde fibrokartilaj oluşumunu analiz etmek için polarize ışık mikroskobu kullanıldı45. NP'nin MC ve uç plakası üzerindeki uzun vadeli etkileri daha fazla çalışma gerektiriyor.
Elli dört adet erkek Yeni Zelanda beyaz tavşanı (ağırlıkları yaklaşık 2,5-3 kg, yaşları 3-3,5 ay) rastgele olarak sham operasyon grubu, kas implantasyonu grubu (ME grubu) ve sinir kökü implantasyonu grubu (NPE grubu) olmak üzere üç gruba ayrıldı. Tüm deneysel prosedürler Tianjin Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylandı ve deneysel yöntemler onaylanmış yönergelere sıkı sıkıya uygun olarak gerçekleştirildi.
S. Sobajima'nın 46 numaralı cerrahi tekniğinde bazı iyileştirmeler yapılmıştır. Her tavşan yan yatış pozisyonuna yerleştirildi ve posterolateral retroperitoneal yaklaşım kullanılarak beş ardışık lomber intervertebral diskin (IVD) ön yüzeyi açığa çıkarıldı. Her tavşana genel anestezi uygulandı (%20 üretan, kulak damarı yoluyla 5 ml/kg). Kaburgaların alt kenarından pelvik kenara kadar, paravertebral kasların 2 cm ventraline uzunlamasına bir deri kesisi yapıldı. L1'den L6'ya kadar sağ anterolateral omurga, üzerindeki deri altı dokusu, retroperitoneal doku ve kasların keskin ve künt diseksiyonu ile açığa çıkarıldı (Şekil 6A). Disk seviyesi, L5-L6 disk seviyesi için anatomik bir referans noktası olarak pelvik kenar kullanılarak belirlendi. 16 gauge'lik bir ponksiyon iğnesi kullanarak L5 omurunun uç plakasına yakın bir yere 3 mm derinliğinde bir delik açın (Şekil 6B). 5 ml'lik bir şırınga kullanarak L1-L2 intervertebral diskindeki otolog nükleus pulposusu aspire edin (Şekil 6C). Her grubun gereksinimlerine göre nükleus pulposusu veya kası çıkarın. Delik derinleştirildikten sonra, ameliyat sırasında omur gövdesinin periosteal dokusuna zarar vermemeye dikkat ederek, derin fasyaya, yüzeysel fasyaya ve cilde emilebilir dikişler yerleştirin.
(A) Posterolateral retroperitoneal yaklaşım yoluyla L5–L6 diski açığa çıkarılır. (B) L5 uç plakasının yakınında bir delik açmak için 16 gauge'lik bir iğne kullanılır. (C) Otolog MF'ler toplanır.
Genel anestezi, kulak damarı yoluyla uygulanan %20 üretan (5 ml/kg) ile sağlandı ve lomber omurga röntgenleri ameliyat sonrası 12, 16 ve 20. haftalarda tekrarlandı.
Tavşanlar, ameliyattan 12, 16 ve 20 hafta sonra kas içi ketamin enjeksiyonu (25,0 mg/kg) ve intravenöz sodyum pentobarbital (1,2 g/kg) ile öldürüldü. Histolojik analiz için omurganın tamamı çıkarıldı ve gerçek analiz yapıldı. Bağışıklık faktörlerindeki değişiklikleri tespit etmek için kantitatif ters transkripsiyon (RT-qPCR) ve Western blotlama kullanıldı.
Tavşanlarda MR incelemeleri, ortogonal uzuv bobini alıcısı ile donatılmış 3.0 T'lik klinik bir manyetik alan (GE Medical Systems, Florence, SC) kullanılarak gerçekleştirildi. Tavşanlar kulak damarı yoluyla %20 üretan (5 mL/kg) ile anestezi altına alındı ve daha sonra lomber bölge 5 inç çapında dairesel bir yüzey bobini (GE Medical Systems) üzerinde merkezlenecek şekilde manyetik alan içinde sırtüstü yatırıldı. Lomber diskin L3-L4'ten L5-L6'ya kadar olan konumunu belirlemek için koronal T2 ağırlıklı lokalizasyon görüntüleri (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) elde edildi. Sagittal düzlem T2 ağırlıklı kesitler aşağıdaki ayarlarla elde edildi: 2200 ms tekrarlama süresi (TR) ve 70 ms yankı süresi (TE) ile hızlı spin-eko sekansı, matris; 260 görsel alan ve sekiz uyaran; kesme kalınlığı 2 mm, aralık 0,2 mm idi.
Son fotoğraf çekildikten ve son tavşan öldürüldükten sonra, histolojik inceleme için sahte, kas içine yerleştirilmiş ve NP diskleri çıkarıldı. Dokular 1 hafta boyunca %10 nötr tamponlu formalinde sabitlendi, etilendiamintetraasetik asit ile dekalsifiye edildi ve parafine kesitlendi. Doku blokları parafine gömüldü ve mikrotom kullanılarak sagital kesitler (5 μm kalınlığında) halinde kesildi. Kesitler hematoksilin ve eozin (H&E) ile boyandı.
Her gruptaki tavşanlardan intervertebral diskler toplandıktan sonra, üreticinin talimatlarına göre UNIQ-10 kolonu (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Çin) ve ImProm II ters transkripsiyon sistemi (Promega Inc., Madison, WI, ABD) kullanılarak toplam RNA ekstrakte edildi. Ters transkripsiyon işlemi gerçekleştirildi.
RT-qPCR, üreticinin talimatlarına göre Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., ABD) ve SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. PCR reaksiyon hacmi 20 μl olup, 1,5 μl seyreltilmiş cDNA ve her bir primerden 0,2 μM içeriyordu. Primerler OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) tarafından tasarlandı ve Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Çin) tarafından üretildi (Tablo 1). Aşağıdaki termal döngü koşulları kullanıldı: 94°C'de 2 dakika süren ilk polimeraz aktivasyon adımı, ardından şablon denatürasyonu için 94°C'de 15 saniye, 60°C'de 1 dakika süren tavlama, uzatma ve floresans ölçümleri için 72°C'de 1 dakika süren 40 döngü. Tüm örnekler üç kez çoğaltıldı ve RT-qPCR analizi için ortalama değer kullanıldı. Çoğaltma verileri FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ABD) kullanılarak analiz edildi. IL-4, IL-17 ve IFN-γ gen ekspresyonu, endojen kontrol (ACTB) ile normalize edildi. Hedef mRNA'nın göreceli ekspresyon seviyeleri 2-ΔΔCT yöntemi kullanılarak hesaplandı.
Doku homojenizatörü kullanılarak RIPA lizis tamponunda (proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli içeren) dokulardan toplam protein ekstrakte edildi ve daha sonra doku kalıntılarını uzaklaştırmak için 4°C'de 20 dakika boyunca 13.000 rpm'de santrifüjlendi. Her bir şeride elli mikrogram protein yüklendi, %10 SDS-PAGE ile ayrıştırıldı ve daha sonra bir PVDF membranına aktarıldı. Bloklama, oda sıcaklığında 1 saat boyunca %0,1 Tween 20 içeren Tris tamponlu salin (TBS) içinde %5 yağsız kuru süt ile gerçekleştirildi. Membran, tavşan anti-dekorin birincil antikoru (1:200 oranında seyreltilmiş; Boster, Wuhan, Çin) (1:200 oranında seyreltilmiş; Bioss, Pekin, Çin) ile 4°C'de bir gece boyunca inkübe edildi ve ikinci günde reaksiyon gerçekleştirildi; İkincil antikor (1:40.000 seyreltmede keçi anti-tavşan immünoglobulin G) ve at kestanesi peroksidazı (Boster, Wuhan, Çin) ile oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edildi. Western blot sinyalleri, X-ışını ışınlamasından sonra kemilüminesan membranda artan kemilüminesans ile tespit edildi. Densitometrik analiz için, blotlar BandScan yazılımı kullanılarak tarandı ve nicelendirildi ve sonuçlar hedef gen immünoreaktivitesinin tubulin immünoreaktivitesine oranı olarak ifade edildi.
İstatistiksel hesaplamalar SPSS 16.0 yazılım paketi (SPSS, ABD) kullanılarak yapılmıştır. Çalışma sırasında toplanan veriler ortalama ± standart sapma (ortalama ± SD) olarak ifade edilmiş ve iki grup arasındaki farklılıkları belirlemek için tek yönlü tekrarlı ölçümler varyans analizi (ANOVA) kullanılarak analiz edilmiştir. P < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.
Bu nedenle, otolog NP'lerin omur gövdesine implante edilmesi ve makroanatomik gözlem, MRI analizi, histolojik değerlendirme ve moleküler biyolojik analiz yapılması yoluyla bir MC hayvan modelinin oluşturulması, insan MC'sinin mekanizmalarını değerlendirmek ve anlamak ve yeni tedavi yöntemleri geliştirmek için önemli bir araç haline gelebilir.
Bu makaleye nasıl atıfta bulunulur: Han, C. ve diğerleri. Otolog nükleus pulposusun lomber omurganın subkondral kemiğine implantasyonu yoluyla Modic değişikliklerinin bir hayvan modeli oluşturuldu. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. ve Boos, N. Bel omurgasının manyetik rezonans görüntülemesi: asemptomatik gönüllülerde disk herniasyonu ve retansiyonu, sinir kökü kompresyonu, uç plak anormallikleri ve faset eklem osteoartritinin yaygınlığı. Radyoloji 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS ve Leboeuf-Eed, K. Modic değişiklikleri ve bunların klinik bulgularla ilişkisi. European Spine Journal: Avrupa Omurga Derneği, Avrupa Omurga Deformitesi Derneği ve Avrupa Servikal Omurga Araştırma Derneği'nin resmi yayını 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., ve diğerleri. Lomber omur uç plakalarındaki Modic değişiklikleri: Orta yaşlı erkek işçilerde bel ağrısı ve siyatik ile ilişkisi ve yaygınlığı. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. ve Dalinka, M. Bel omurgasının dejeneratif hastalığında uç plaka yakınındaki kemik iliği değişikliklerinin MR görüntülemesi. AJR. Amerikan Radyoloji Dergisi 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ ve Carter, JR Dejeneratif disk hastalığı: MR ile vertebral kemik iliği değişikliklerinin değerlendirilmesi. Radyoloji 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS ve Carter, JR Dejeneratif disk hastalığının görüntülenmesi. Radyoloji 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, ve diğerleri. Genel popülasyonda neovertebral uç plak (Modic) sinyal değişikliklerinin belirleyicileri. European Spine Journal: Avrupa Omurga Derneği, Avrupa Omurga Deformitesi Derneği ve Avrupa Servikal Omurga Araştırma Derneği'nin Resmi Yayını, Bölüm 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB ve Mannisch, K. Lomber disk herniasyonundan sonra Modic değişiklikleri. European Spine Journal: Avrupa Omurga Derneği, Avrupa Omurga Deformitesi Derneği ve Avrupa Servikal Omurga Araştırma Derneği'nin Resmi Yayını 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. ve Kaapa, E. Modic tip I değişiklikleri, hızla ilerleyen deformasyonel disk dejenerasyonunu öngörebilir: 1 yıllık prospektif çalışma. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ ve Fan, SW Modic değişiklikleri: bel fıtığı dejenerasyonuna olası nedenler ve katkıları. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV İç disk rüptürü. 50 yılı aşkın süredir disk prolapsusu sorunları. Omurga (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Yayın tarihi: 13 Aralık 2024