Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünde sınırlı CSS desteği vardır. En iyi sonuçlar için, daha yeni bir tarayıcı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu devre dışı bırakmayı) kullanmanızı öneririz. Bu arada, sürekli destek sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
Modic değişim hayvan modellerinin (MC) kurulması MC'yi incelemek için önemli bir temeldir. Elli dört Yeni Zelanda Beyaz Tavşan, sahte operasyon grubu, Muscle İmplantasyon Grubu (ME grubu) ve Nucleus Pulposus İmplantasyon Grubu'na (NPE Grubu) ayrıldı. NPE grubunda, intervertebral disk anterolateral lomber cerrahi yaklaşımla maruz bırakıldı ve L5 vertebral gövdeyi uç plakanın yakınında delmek için bir iğne kullanıldı. NP, bir şırınga ile L1/2 intervertebral diskten çıkarıldı ve içine enjekte edildi. Subkondral kemikte bir delik açma. Kas implantasyon grubundaki ve sahte operasyon grubundaki cerrahi prosedürler ve sondaj yöntemleri, NP implantasyon grubundakilerle aynıydı. ME grubunda deliğe bir kas parçası yerleştirildi, sahte operasyon grubunda deliğe hiçbir şey yerleştirilmedi. Operasyondan sonra MRI taraması ve moleküler biyolojik testler yapıldı. NPE grubundaki sinyal değişti, ancak sahte operasyon grubunda ve ME grubunda belirgin bir sinyal değişikliği yoktu. Histolojik gözlem, implantasyon bölgesinde anormal doku proliferasyonunun gözlendiğini ve NPE grubunda IL-4, IL-17 ve IFN-y ekspresyonunun arttığını gösterdi. NP'nin subkondral kemiğe implantasyonu, MC'nin bir hayvan modelini oluşturabilir.
Modik değişiklikler (MC), manyetik rezonans görüntüleme (MRI) üzerinde görülebilen vertebral uç plakaların ve bitişik kemik iliğinin lezyonlarıdır. İlişkili semptomları olan bireylerde oldukça yaygındır1. Birçok çalışma, bel ağrısı (LBP) 2,3 ile ilişkisi nedeniyle MC'nin önemini vurgulamıştır. De Roos ve ark.4 ve Modic ve ark.5, önce vertebral kemik iliğinde üç farklı tipte subkondral sinyal anormalliği tanımladılar. Modic Tip I değişiklikleri, T1 ağırlıklı (T1W) dizilerde hippointens ve T2 ağırlıklı (T2W) dizilerde hiperintendir. Bu lezyon, kemik iliğinde fissür uç plakalarını ve bitişik vasküler granülasyon dokusunu ortaya çıkarır. Modic Tip II değişiklikleri hem T1W hem de T2W sekanslarında yüksek sinyal gösterir. Bu tip lezyonda, bitişik kemik iliğinin histolojik yağ değiştirmesinin yanı sıra uç plakası yıkımı bulunabilir. Modic Tip III değişiklikleri T1W ve T2W sekanslarında düşük sinyal gösterir. Uç plakalara karşılık gelen sklerotik lezyonlar gözlemlenmiştir6. MC, omurganın patolojik bir hastalığı olarak kabul edilir ve omurganın birçok dejeneratif hastalığı ile yakından ilişkilidir7,8,9.
Mevcut veriler göz önüne alındığında, çeşitli çalışmalar MC'nin etiyolojisi ve patolojik mekanizmaları hakkında ayrıntılı bilgiler sağlamıştır. Albert ve ark. MC'nin disk herniasyondan kaynaklanabileceğini öne sürdü8. Hu ve ark. MC'yi şiddetli disk dejenerasyonuna atfedildi10. KROC, tekrarlayan disk travmasının uç plakada mikrotarlara yol açabileceğini belirten “dahili disk rüptürü” kavramını önerdi. Yarık oluşumundan sonra, çekirdek pulposus (NP) tarafından uç plaka yıkımı, bir otoimmün yanıtı tetikleyebilir, bu da MC11'in gelişimine yol açar. Ma ve ark. benzer bir görüş paylaştı ve NP'nin neden olduğu otoimmünitenin MC12 patogenezinde önemli bir rol oynadığını bildirdi.
Bağışıklık sistemi hücreleri, özellikle CD4+ T yardımcı lenfositleri, otoimmünite patogenezinde kritik bir rol oynar13. Yakın zamanda keşfedilen TH17 altkümesi, proinflamatuar sitokin IL-17'yi üretir, kemokin ekspresyonunu teşvik eder ve hasarlı organlardaki T hücrelerini IFN-γ14 üretmek için uyarır. Th2 hücreleri ayrıca bağışıklık tepkilerinin patogenezinde benzersiz bir rol oynar. Temsili bir Th2 hücresi olarak IL-4'ün ekspresyonu ciddi immünopatolojik sonuçlara yol açabilir15.
MC16,17,18,19,20,21,22,23,24 üzerinde birçok klinik çalışma yapılmış olsa da, hala insanlarda sıklıkla meydana gelen ve olabilecek MC sürecini taklit edebilen uygun hayvan deneysel modellerinin eksikliği vardır. Etiyolojiyi veya hedefli tedavi gibi yeni tedavileri araştırmak için kullanılır. Bugüne kadar, altta yatan patolojik mekanizmaları incelediği bildirilmiştir.
Albert ve MA tarafından önerilen otoimmün teoriye dayanarak, bu çalışma, delinmiş vertebral uç plakasının yakınındaki NP'yi ototransplant ederek basit ve tekrarlanabilir bir tavşan MC modeli oluşturmuştur. Diğer hedefler, hayvan modellerinin histolojik özelliklerini gözlemlemek ve MC gelişiminde NP'nin spesifik mekanizmalarını değerlendirmektir. Bu amaçla, MC'nin ilerlemesini incelemek için moleküler biyoloji, MRG ve histolojik çalışmalar gibi teknikleri kullanıyoruz.
İki tavşan ameliyat sırasında kanamadan öldü ve MRG sırasında anestezi sırasında dört tavşan öldü. Kalan 48 tavşan hayatta kaldı ve ameliyattan sonra davranışsal veya nörolojik belirtiler göstermedi.
MRG, gömülü dokunun farklı deliklerde sinyal yoğunluğunun farklı olduğunu gösterir. NPE grubundaki L5 vertebral gövdesinin sinyal yoğunluğu, yerleştirilmesinden sonra 12, 16 ve 20 hafta sonra yavaş yavaş değişti (T1W sekansı düşük sinyal gösterdi ve T2W sekansı karışık sinyal artı düşük sinyal gösterdi) (Şekil 1C), MRI görünümleri ise Diğer iki gömülü parça grubunun aynı dönemde nispeten kararlı kalmasıdır (Şekil 1A, b).
(A) Tavşan lomber omurganın temsili sıralı MRI'ları 3 zaman noktasında. Sham-operasyon grubunun görüntülerinde sinyal anormallikleri bulunmadı. (B) ME grubundaki vertebral gövdenin sinyal özellikleri, sahte operasyon grubundakine benzer ve gömme bölgesinde zaman içinde önemli bir sinyal değişikliği gözlenmez. (C) NPE grubunda, düşük sinyal T1W sekansında açıkça görülebilir ve karışık sinyal ve düşük sinyal T2W sekansında açıkça görülebilir. 12 haftalık dönemden 20 haftalık süreye kadar, T2W sekansındaki düşük sinyalleri çevreleyen sporadik yüksek sinyaller azalır.
NPE grubundaki vertebral gövdenin implantasyon bölgesinde belirgin kemik hiperplazisi görülebilir ve kemik hiperplazisi, NPE grubuna kıyasla 12 ila 20 hafta (Şekil 2C) arasında daha hızlı gerçekleşir, modellenmiş vertebralde önemli bir değişiklik gözlenmez bedenler; Sham Grubu ve Ben Grubu (Şekil 2C) 2A, B).
(A) İmplante edilen kısımdaki vertebral gövdenin yüzeyi çok pürüzsüzdür, delik iyi iyileşir ve vertebral gövdede hiperplazi yoktur. (B) ME grubundaki implante edilen bölgenin şekli, sahte işlem grubundakine benzer ve implante edilen bölgenin zaman içinde belirgin bir değişiklik yoktur. (C) NPE grubundaki implante edilen bölgede kemik hiperplazisi meydana geldi. Kemik hiperplazisi hızla arttı ve hatta intervertebral diskten kontralateral vertebral gövdeye uzandı.
Histolojik analiz, kemik oluşumu hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlar. Şekil 3, H&E ile boyanmış postoperatif bölümlerin fotoğraflarını göstermektedir. Sham-operasyon grubunda kondrositler iyi düzenlenmiş ve hücre proliferasyonu tespit edilmemiştir (Şekil 3A). ME grubundaki durum, sahte operasyon grubundakine benzerdi (Şekil 3B). Bununla birlikte, NPE grubunda implantasyon bölgesinde çok sayıda kondrosit ve NP benzeri hücrelerin proliferasyonu gözlenmiştir (Şekil 3C);
(A) Trabeküller uç plakanın yakınında görülebilir, kondrositler düzgün hücre boyutu ve şekli ile düzgün bir şekilde düzenlenir ve proliferasyon (40 kez). (B) ME grubundaki implantasyon bölgesinin durumu sahte grubun durumu. Trabeküller ve kondrositler görülebilir, ancak implantasyon bölgesinde (40 kez) belirgin bir proliferasyon yoktur. (B) Kondrositlerin ve NP benzeri hücrelerin önemli ölçüde çoğaldığı ve kondrositlerin şekli ve boyutunun düzensiz olduğu görülebilir (40 kez).
Hem NPE hem de ME gruplarında interlökin 4 (IL-4) mRNA, interlökin 17 (IL-17) mRNA ve interferon γ (IFN-y) mRNA'nın ekspresyonu gözlendi. Hedef genlerin ekspresyon seviyeleri karşılaştırıldığında, IL-4, IL-17 ve IFN-y'nin gen ifadeleri, NPE grubunda ME grubu ve sahte çalışma grubuna kıyasla önemli ölçüde artmıştır (Şekil 4) (P <0.05). Sham operasyon grubu ile karşılaştırıldığında, ME grubundaki IL-4, IL-17 ve IFN-y ekspresyon seviyeleri sadece hafifçe arttı ve istatistiksel değişime ulaşmadı (P> 0.05).
NPE grubundaki IL-4, IL-17 ve IFN-y'nin mRNA ekspresyonu, sahte operasyon grubu ve ME grubundakilerden önemli ölçüde daha yüksek bir eğilim göstermiştir (P <0.05).
Buna karşılık, ME grubundaki ekspresyon seviyeleri anlamlı bir fark göstermedi (p> 0.05).
Western blot analizi, değiştirilmiş mRNA ekspresyon paternini doğrulamak için IL-4 ve IL-17'ye karşı ticari olarak temin edilebilen antikorlar kullanılarak yapıldı. Şekil 5A, B'de gösterildiği gibi, ME grubu ve sahte operasyon grubu ile karşılaştırıldığında, NPE grubundaki IL-4 ve IL-17'nin protein seviyeleri önemli ölçüde artmıştır (P <0.05). Sham operasyon grubu ile karşılaştırıldığında, ME grubundaki IL-4 ve IL-17'nin protein seviyeleri de istatistiksel olarak anlamlı değişikliklere ulaşamadı (P> 0.05).
(A) NPE grubundaki IL-4 ve IL-17'nin protein seviyeleri, ME grubu ve plasebo grubundakilerden önemli ölçüde daha yüksekti (P <0.05). (B) Western blot histogramı.
Ameliyat sırasında elde edilen sınırlı sayıda insan örneği nedeniyle, MC'nin patogenezi ile ilgili açık ve ayrıntılı çalışmalar biraz zordur. Potansiyel patolojik mekanizmalarını incelemek için bir hayvan MC modeli kurmaya çalıştık. Aynı zamanda, NP otograft tarafından indüklenen MC seyrini takip etmek için radyolojik değerlendirme, histolojik değerlendirme ve moleküler biyolojik değerlendirme kullanılmıştır. Sonuç olarak, NP implantasyon modeli, sinyal yoğunluğunda 12 haftadan 20 haftadan 20 haftaya kadar kademeli bir değişiklik ile sonuçlandı (T1W dizilerindeki karışık düşük sinyal ve T2W dizilerinde düşük sinyal), doku değişikliklerini ve histolojik ve moleküler Biyolojik değerlendirmeler radyolojik çalışmanın sonuçlarını doğruladı.
Bu deneyin sonuçları, NPE grubunda vertebral vücut ihlali bölgesinde görsel ve histolojik değişikliklerin meydana geldiğini göstermektedir. Aynı zamanda, IL-4, IL-17 ve IFN-y genlerinin yanı sıra IL-4, IL-17 ve IFN-y ekspresyonu gözlendi, bu da vertebralde otolog çekirdek pulposus dokusunun ihlal edildiğini gösteriyor Vücut bir dizi sinyal ve morfolojik değişikliğe neden olabilir. Hayvan modelinin vertebral bedenlerinin sinyal özelliklerinin (T1W sekansındaki düşük sinyal, T2W sekansındaki karışık sinyal ve düşük sinyal) insan vertebral hücrelerininkine çok benzer olduğunu ve MRI özelliklerinin de olduğunu bulmak kolaydır. Histoloji ve brüt anatominin gözlemlerini doğrulayın, yani vertebral vücut hücrelerindeki değişiklikler ilerleyicidir. Akut travmanın neden olduğu inflamatuar yanıt delinmeden hemen sonra ortaya çıkabilse de, MRI sonuçları, ponksiyondan 12 hafta sonra giderek artan sinyal değişikliklerinin ortaya çıktığını ve MRG değişikliklerinin iyileşme veya tersine dönme belirtisi olmadan 20 haftaya kadar devam ettiğini göstermiştir. Bu sonuçlar, otolog vertebral NP'nin tavşanlarda aşamalı MV oluşturmak için güvenilir bir yöntem olduğunu göstermektedir.
Bu delme modeli yeterli beceri, zaman ve cerrahi çaba gerektirir. Ön deneylerde, paravertebral ligamentöz yapıların diseksiyonu veya aşırı uyarılması vertebral osteofitlerin oluşumuna neden olabilir. Bitişik disklere zarar vermemeye veya tahriş etmeye özen gösterilmelidir. Tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için penetrasyon derinliği kontrol edilmesi gerektiğinden, 3 mm uzunluğundaki bir iğnenin kılıfını keserek manuel olarak bir fiş yaptık. Bu fişi kullanmak vertebral gövdede düzgün delme derinliği sağlar. Ön deneylerde, operasyonda yer alan üç ortopedik cerrah, 16 gauge iğnenin 18 gauge iğneden veya diğer yöntemlerden daha kolay çalışmasını buldu. Sondaj sırasında aşırı kanamayı önlemek için, iğneyi bir süre sabit tutmak daha uygun bir yerleştirme deliği sağlayacaktır, bu da belirli bir MC derecesinin bu şekilde kontrol edilebileceğini düşündürmektedir.
Birçok çalışma MC'yi hedeflemiş olsa da, MC25,26,27'nin etiyolojisi ve patogenezi hakkında çok az şey bilinmektedir. Önceki çalışmalarımıza dayanarak, otoimmünitenin MC12'nin oluşumunda ve gelişiminde önemli bir rol oynadığını bulduk. Bu çalışma, antijen stimülasyonundan sonra CD4+ hücrelerinin ana farklılaşma yolları olan IL-4, IL-17 ve IFN-y'nin kantitatif ekspresyonunu incelemiştir. Çalışmamızda, negatif grupla karşılaştırıldığında, NPE grubu IL-4, IL-17 ve IFN-y ekspresyonu daha yüksekti ve IL-4 ve IL-17'nin protein seviyeleri de daha yüksekti.
Klinik olarak, Disk Herniation28 hastalarından NP hücrelerinde IL-17 mRNA ekspresyonu arttırılır. Artan IL-4 ve IFN-y ekspresyon seviyeleri, sağlıklı kontroller29'a kıyasla akut kompresör olmayan bir disk herniasyon modelinde de bulundu29. IL-17, inflamasyonda önemli bir rol oynar, otoimmün hastalıklarda doku hasarı 30 ve IFN-y31'e bağışıklık tepkisini arttırır. MRL/LPR fareleri32 ve otoimmünite duyarlı fareler33'te artmış IL-17 aracılı doku hasarı bildirilmiştir. IL-4, proenflamatuar sitokinlerin (IL-1β ve TNFa gibi) ve makrofaj aktivasyonunun ekspresyonunu inhibe edebilir34. IL-4'ün mRNA ekspresyonunun NPE grubunda aynı zaman noktasında IL-17 ve IFN-y ile karşılaştırıldığında farklı olduğu bildirilmiştir; NPE grubundaki IFN-y'nin mRNA ekspresyonu, diğer gruplardan önemli ölçüde daha yüksekti. Bu nedenle, IFN-y üretimi, NP interkalasyonunun neden olduğu inflamatuar yanıtın aracısı olabilir. Çalışmalar, IFN-y'nin aktif tip 1 yardımcı T hücreleri, doğal katil hücreler ve makrofajlar 35,36 dahil olmak üzere çoklu hücre tipleri tarafından üretildiğini ve bağışıklık tepkilerini destekleyen önemli bir pro-enflamatuar sitokin olduğunu göstermiştir37.
Bu çalışma otoimmün yanıtın MC'nin oluşumu ve gelişiminde rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Luoma ve ark. MC ve belirgin NP'nin sinyal özelliklerinin MRG'de benzer olduğunu ve her ikisinin de T2W sekansında yüksek sinyal gösterdiğini buldu38. Bazı sitokinlerin IL-139 gibi MC oluşumu ile yakından ilişkili olduğu doğrulanmıştır. Ma ve ark. NP'nin yukarı veya aşağı doğru çıkıntısının MC12'nin oluşumu ve gelişimi üzerinde büyük bir etkiye sahip olabileceğini öne sürdü. Bobechko40 ve Herzbein ve ark.41, NP'nin doğumdan itibaren vasküler dolaşıma giremeyen bir immünotolerant doku olduğunu bildirmiştir. NP çıkıntıları, yabancı cisimleri kan kaynağına sokar, böylece yerel otoimmün reaksiyonlara aracılık eder42. Otoimmün reaksiyonlar çok sayıda bağışıklık faktörü indükleyebilir ve bu faktörler sürekli olarak dokulara maruz kaldığında, sinyallemede değişikliklere neden olabilir 43. Bu çalışmada, IL-4, IL-17 ve IFN-y'nin aşırı ekspresyonu tipik immün faktörlerdir, bu da NP ve MCS44 arasındaki yakın ilişkiyi daha da kanıtlamaktadır. Bu hayvan modeli NP atılımını ve uç plakaya girişi taklit eder. Bu süreç ayrıca otoimmünitenin MC üzerindeki etkisini ortaya çıkarmıştır.
Beklendiği gibi, bu hayvan modeli bize MC'yi incelemek için olası bir platform sağlar. Bununla birlikte, bu modelin hala bazı sınırlamaları vardır: Birincisi, hayvan gözlem aşaması sırasında, bazı ara evre tavşanların histolojik ve moleküler biyoloji testi için ötenazi yapılması gerekir, bu nedenle bazı hayvanlar zamanla “kullanım dışı”. İkincisi, bu çalışmada üç zaman noktası belirlenmesine rağmen, maalesef sadece bir tip MC (Modic Tip I değişim) modelledik, bu nedenle insan hastalığı geliştirme sürecini temsil etmek yeterli değildir ve daha fazla zaman noktasının ayarlanması gerekir. Tüm sinyal değişikliklerini daha iyi gözlemleyin. Üçüncüsü, doku yapısındaki değişiklikler gerçekten histolojik boyama ile açıkça gösterilebilir, ancak bazı özel teknikler bu modeldeki mikroyapısal değişiklikleri daha iyi ortaya çıkarabilir. Örneğin, tavşan intervertebral disklerde fibrokartilaj oluşumunu analiz etmek için polarize ışık mikroskopisi kullanıldı45. NP'nin MC ve uç plakası üzerindeki uzun vadeli etkileri daha fazla çalışma gerektirir.
Elli dört erkek Yeni Zelanda beyaz tavşanlar (ağırlık yaklaşık 2.5-3 kg, 3-3.5 yaş) rastgele sahte çalışma grubu, kas implantasyon grubu (ME grubu) ve sinir kökü implantasyon grubuna (NPE grubu) ayrıldı. Tüm deneysel prosedürler Tianjin Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır ve deney yöntemleri onaylanmış kılavuzlara sıkı sıkıya uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
S. sobajima 46'nın cerrahi tekniğinde bazı gelişmeler yapılmıştır. Her tavşan lateral bir yatma pozisyonuna yerleştirildi ve birbirini izleyen beş lomber intervertebral disklerin (IVD'ler) ön yüzeyi, posterolateral retroperitoneal yaklaşım kullanılarak maruz bırakıldı. Her tavşana genel anestezi (% 20 üretan, kulak veniyle 5 mL/kg) verildi. Kaburgaların alt kenarından, paravertebral kaslara 2 cm ventral olan pelvik ağzına kadar uzunlamasına bir cilt insizyonu yapıldı. L1 ila L6'dan sağ anterolateral omurga, üstteki subkutan doku, retroperitoneal doku ve kasların keskin ve künt diseksiyonu ile maruz bırakıldı (Şekil 6A). Disk seviyesi, L5-L6 disk seviyesi için anatomik bir dönüm noktası olarak pelvik ağzı kullanılarak belirlendi. L5 vertebra'nın uç plakasının yakınında 3 mm derinliğe kadar bir delik açmak için 16 gauge ponksiyon iğnesi kullanın (Şekil 6B). L1-L2 intervertebral diskinde otolog çekirdek pulpozusunu aspirasyon yapmak için 5 ml'lik bir şırınga kullanın (Şekil 6C). Her grubun gereksinimlerine göre çekirdek pulposus veya kasını çıkarın. Matkap deliği derinleştikten sonra, ameliyat sırasında vertebral vücudun periosteal dokusuna zarar vermemeye dikkat ederek, derin fasyaya, yüzeysel fasyaya ve cilde emilebilir dikişler yerleştirilir.
(A) L5 -L6 diski posterolateral retroperitoneal yaklaşımla ortaya çıkar. (B) L5 uç plakasının yakınında bir delik açmak için 16 gauge bir iğne kullanın. (C) Otolog MF'ler hasat edilir.
Genel anestezi, kulak ven yoluyla uygulanan% 20 üretan (5 mL/kg) ile uygulandı ve lomber omurga radyografileri ameliyat sonrası 12, 16 ve 20 haftada tekrarlandı.
Tavşanlar, ameliyattan 12, 16 ve 20 hafta sonra kas içi ketamin (25.0 mg/kg) ve intravenöz sodyum pentobarbital (1.2 g/kg) enjeksiyonu ile feda edildi. Histolojik analiz için tüm omurga çıkarıldı ve gerçek analiz yapıldı. Bağışıklık faktörlerindeki değişiklikleri tespit etmek için kantitatif ters transkripsiyon (RT-qpcr) ve Western blotlama kullanıldı.
MRI muayeneleri tavşanlarda bir dikey uzuv bobin alıcısı ile donatılmış 3.0 T klinik mıknatıs (GE Medical Systems, Floransa, SC) kullanılarak yapıldı. Tavşanlar, kulak ven yoluyla% 20 üretan (5 ml/kg) ile anestezi uygulandı ve daha sonra lomber bölgesi 5 inç çaplı dairesel bir yüzey bobini (GE tıbbi sistemleri) üzerinde ortalanmış mıknatıs içine sırtüstü yerleştirildi. Koronal T2 ağırlıklı lokalizör görüntüleri (TR, 1445 ms; TE, 37 ms), lomber diskin yerini L3-L4 ila L5-L6 arasında tanımlamak için elde edildi. Sagital düzlem T2 ağırlıklı dilimler aşağıdaki ayarlarla elde edildi: 2200 ms'lik tekrarlama süresi (TR) ve 70 ms'lik bir yankı süresi (TE) olan hızlı spin-eko sekansı; 260 ve sekiz uyaran görme alanı; Kesme kalınlığı 2 mm, boşluk 0.2 mm idi.
Son fotoğraf çekildikten ve son tavşan öldürüldükten sonra, sahte, kas gömülü ve NP diskleri histolojik muayene için çıkarıldı. Dokular, 1 hafta boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitlendi, etilendiaminetraasetik asit ve parafin kesildi. Doku blokları parafine gömüldü ve bir mikrotom kullanılarak sagital bölümlere (5 um kalınlıkta) kesildi. Kesitler hematoksilin ve eozin (H&E) ile boyandı.
Her gruptaki tavşanlardan intervertebral diskleri topladıktan sonra, toplam RNA, üreticinin talimatlarına ve bir Hasçılış II Ters Transkripsiyon Sistemi (Promega Inc. (Promega Inc. , Madison, WI, ABD). Ters transkripsiyon yapıldı.
RT-QPCR, üreticinin talimatlarına göre bir Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., ABD) ve SYBR Green Jump Start Taq Readymix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi. PCR reaksiyon hacmi 20 uL idi ve her bir primerin 1.5 uL seyreltilmiş cDNA ve 0.2 uM içeriyordu. Primerler Oligoperfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) tarafından tasarlandı ve Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Çin) tarafından üretildi (Tablo 1). Aşağıdaki termal döngü koşulları kullanıldı: 2 dakika boyunca 94 ° C'de başlangıç polimeraz aktivasyon aşaması, daha sonra şablon denatürasyonu için her biri 94 ° C'de 15 saniye, 60 ° C'de 1 dakika tavlama, uzatma ve floresan. Ölçümler 72 ° C'de 1 dakika gerçekleştirildi. Tüm numuneler üç kez amplifiye edildi ve ortalama değer RT-qPCR analizi için kullanıldı. Amplifikasyon verileri FlexStation 3 (Moleküler Cihazlar, Sunnyvale, CA, ABD) kullanılarak analiz edildi. IL-4, IL-17 ve IFN-y gen ekspresyonu, endojen kontrole (ACTB) normalleştirildi. Hedef mRNA'nın nispi ekspresyon seviyeleri, 2-ΔCT yöntemi kullanılarak hesaplandı.
Toplam protein, RIPA liziz tamponunda (bir proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli içeren) bir doku homojenleştiricisi kullanılarak dokulardan ekstrakte edildi ve daha sonra doku döküntülerini çıkarmak için 4 ° C'de 20 dakika boyunca 13.000 rpm'de santrifüjlendi. Şerit başına elli mikrogram protein yüklendi,% 10 SDS-PAGE ile ayrıldı ve daha sonra bir PVDF membranına aktarıldı. Engelleme, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.1 Tween 20 içeren Tris tamponlu salin (TBS) içinde% 5 yağsız kuru sütte gerçekleştirildi. Membran, 4 ° C'de gece boyunca tavşan anti-Decorin primer antikoru (seyreltilmiş 1: 200; Boster, Wuhan, Çin) (seyreltilmiş 1: 200; Bioss, Pekin, Çin) ile inkübe edildi ve ikinci günlerde reaksiyona girdi; Oda sıcaklığında 1 saat boyunca yaban turpu peroksidaz (Boster, Wuhan, Çin) ile birleştirilmiş ikincil antikor (keçi anti-tavşan immünoglobulin G'de 1: 40.000 seyreltme). Western blot sinyalleri, x-ışını ışınlamasından sonra kemilüminesan membran üzerinde artan kemilüminesans ile tespit edildi. Densitometrik analiz için lekeler tarandı ve bant ekibi yazılımı kullanılarak ölçüldü ve sonuçlar hedef gen immünoreaktivitesinin tubulin immünoreaktivitesine oranı olarak ifade edildi.
İstatistiksel hesaplamalar SPSS16.0 yazılım paketi (SPSS, ABD) kullanılarak yapıldı. Çalışma sırasında toplanan veriler ortalama ± standart sapma (ortalama ± SD) olarak ifade edildi ve iki grup arasındaki farklılıkları belirlemek için tek yönlü tekrarlanan ölçümler varyans analizi (ANOVA) kullanılarak analiz edildi. P <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.
Bu nedenle, otolog NP'leri vertebral gövdeye implante ederek ve makroanatomik gözlem, MRG analizi, histolojik değerlendirme ve moleküler biyolojik analiz yaparak bir MC hayvan modelinin oluşturulması, insan MC'nin mekanizmalarını değerlendirmek ve anlamak için önemli bir araç haline gelebilir ve yeni terapötik yeni terapötikler geliştirebilir müdahaleler.
Bu makaleyi nasıl belirtilir: Han, C. ve ark. Otolog çekirdek pulpozusunu lomber omurganın subkondral kemiğine implante edilerek modic değişikliklerin bir hayvan modeli oluşturuldu. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/SREP35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. ve Boos, N. Lomber Omurganın Manyetik Rezonans Görüntüleme: Disk Herniasyon ve Tutma Prevalansı, Sinir Kök Sıkıştırma, Uç Plaka Anormallikleri ve Faset Eklem Osteoartrit Asimptomatik Gönüllülerde . oran. Radyoloji 209, 661-666, doi: 10.1148/radyoloji.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS ve Leboeuf-Eent, K. Modic değişiklikleri ve bunların klinik bulgularla ilişkisi. Avrupa Omurga Dergisi: Avrupa Omurga Derneği, Avrupa Omurga Deformitesi Derneği ve Avrupa Servikal Omurga Araştırmaları Derneği 15, 1312–1319, DOI: 10.1007/s00586-006-0185-X (2006).
Kuisma, M., vd. Lomber vertebral uç plakalarda modik değişiklikler: orta yaşlı erkek işçilerde bel ağrısı ve siyatik ile prevalans ve ilişki. Omurga 32, 1116–1122, doi: 10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
De Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. ve Dalinka, M. Kemik iliği MRI, lomber omurganın dejeneratif hastalığında uç plakanın yakınında değişir. Ajr. Amerikan Radyoloji Dergisi 149, 531-534, DOI: 10.2214/AJR.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ ve Carter, JR dejeneratif disk hastalığı: MRG ile vertebral kemik iliği değişikliklerinin değerlendirilmesi. Radyoloji 166, 193–199, doi: 10.1148/radyoloji. 166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS ve Carter, dejeneratif disk hastalığının JR görüntüleme. Radyoloji 168, 177-186, DOI: 10.1148/radyoloji.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, vd. Genel popülasyonda Neovertebral uç plaka (MODIC) sinyal değişikliklerinin belirleyicileri. Avrupa Omurga Dergisi: Avrupa Omurga Derneği, Avrupa Omurga Deformitesi Derneği ve Avrupa Servikal Omurga Araştırmaları Derneği, Bölüm 19, 129-135, DOI: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB ve Mannisch, K. Lomber disk herniasyonundan sonra modik değişiklikler. Avrupa Omurga Dergisi: Avrupa Omurga Derneği, Avrupa Omurga Deformitesi Derneği ve Avrupa Servikal Omurga Araştırmaları Derneği 16, 977-982, DOI: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M. ve Kaapa, E. Modic Tip I değişiklikleri hızla ilerleyici deformasyonel disk dejenerasyonunu tahmin edebilir: 1 yıllık prospektif bir çalışma. Avrupa Omurga Dergisi 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ ve Fan, SW MODIC değişiklikleri: Olası nedenler ve lomber disk dejenerasyonuna katkı. Tıbbi Hipotezler 73, 930–932, DOI: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV İç Disk Rüptürü. 50 yıldan fazla disk prolapsusu sorunları. Omurga (Phila PA 1976) 11, 650-653 (1986).
Gönderme Zamanı: 13-2024