nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için, en son tarayıcı sürümünü kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Ayrıca, sürekli desteği sağlamak için bu site stil ve JavaScript içermeyecektir.
İskelet kası, çoğunlukla miyofibrillerden oluşan heterojen bir dokudur ve insanlarda tipik olarak üç tipe ayrılır: bir "yavaş" (tip 1) ve iki "hızlı" (tip 2A ve 2X). Bununla birlikte, geleneksel miyofibril tipleri arasındaki ve içindeki heterojenlik hala yeterince anlaşılmamıştır. İnsan vastus lateralis kasından sırasıyla 1050 ve 1038 bireysel miyofibrile transkriptomik ve proteomik yaklaşımlar uyguladık. Proteomik çalışma erkekleri, transkriptomik çalışma ise 10 erkek ve 2 kadını içermiştir. Miyozin ağır zincir izoformlarına ek olarak, çok boyutlu miyofibriller arası değişkenliğin kaynakları olarak metabolik proteinleri, ribozomal proteinleri ve hücresel bağlantı proteinlerini tanımladık. Ayrıca, yavaş ve hızlı lif kümelerinin tanımlanmasına rağmen, verilerimiz tip 2X liflerinin diğer hızlı kasılan liflerden fenotipik olarak ayırt edilemez olduğunu göstermektedir. Ayrıca, miyozin ağır zincirine dayalı sınıflandırma, nemalin miyopatilerinde miyofiber fenotipini tanımlamak için yetersizdir. Genel olarak, verilerimiz, varyasyon kaynaklarının miyozin ağır zincir izoformlarının ötesine uzandığı çok boyutlu miyofiber heterojenliğine işaret etmektedir.
Hücresel heterojenlik, tüm biyolojik sistemlerin doğasında var olan bir özelliktir ve hücrelerin dokuların ve hücrelerin farklı ihtiyaçlarını karşılamak üzere uzmanlaşmasına olanak tanır.1 İskelet kası lifi heterojenliğine ilişkin geleneksel görüş, motor nöronların bir motor ünite içindeki lif tipini tanımladığı ve lif tipinin (yani insanlarda tip 1, tip 2A ve tip 2X) miyozin ağır zincir (MYH) izoformlarının özellikleriyle belirlendiği yönündeydi.2 Bu, başlangıçta pH ATPaz kararsızlığına3,4 ve daha sonra MYH'nin moleküler ekspresyonuna5 dayanıyordu. Bununla birlikte, farklı oranlarda birden fazla MYH'yi birlikte eksprese eden "karışık" liflerin tanımlanması ve ardından kabul edilmesiyle, iskelet kası lifleri giderek farklı lif tipleri yerine bir süreklilik olarak görülmektedir.6 Buna rağmen, alan hala miyofiber sınıflandırması için birincil sınıflandırıcı olarak MYH'ye büyük ölçüde güvenmektedir; bu görüş, MYH ekspresyon profilleri ve lif tiplerinin aralığı insanlardakinden farklı olan erken kemirgen çalışmalarının sınırlamaları ve önemli önyargılarından etkilenmiş olabilir.2 Durum Bu durum, farklı insan iskelet kaslarının çeşitli lif tipleri sergilemesi gerçeğiyle daha da karmaşık hale gelmektedir.7 Vastus lateralis, orta düzeyde (ve dolayısıyla temsili) bir MYH ekspresyon profiline sahip karma bir kastır.7 Ayrıca, örnekleme kolaylığı onu insanlarda en iyi incelenen kas yapmaktadır.
Bu nedenle, güçlü “omik” araçlar kullanılarak iskelet kas lifi çeşitliliğinin tarafsız bir şekilde incelenmesi kritik öneme sahip olmakla birlikte, iskelet kas liflerinin çok çekirdekli yapısı nedeniyle kısmen de olsa zorlayıcıdır. Bununla birlikte, transkriptomik8,9 ve proteomik10 teknolojileri, çeşitli teknolojik gelişmeler sayesinde son yıllarda hassasiyet açısından bir devrim geçirmiş ve iskelet kasının tek lif çözünürlüğünde analizine olanak sağlamıştır. Sonuç olarak, tek lif çeşitliliğinin ve bunların atrofik uyaranlara ve yaşlanmaya verdiği yanıtın karakterize edilmesinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir11,12,13,14,15,16,17,18. Daha da önemlisi, bu teknolojik gelişmelerin klinik uygulamaları vardır ve hastalıkla ilişkili düzensizliğin daha ayrıntılı ve hassas bir şekilde karakterize edilmesine olanak tanır. Örneğin, en yaygın kalıtsal kas hastalıklarından biri olan nemalin miyopatisinin (MIM 605355 ve MIM 161800) patofizyolojisi karmaşık ve kafa karıştırıcıdır.19,20 Bu nedenle, iskelet kası liflerinin düzensizliğinin daha iyi karakterize edilmesi, bu hastalığı anlamamızda önemli ilerlemelere yol açabilir.
İnsan biyopsi örneklerinden elle izole edilen tek iskelet kas liflerinin transkriptomik ve proteomik analizi için yöntemler geliştirdik ve bunları binlerce life uygulayarak insan iskelet kas liflerinin hücresel heterojenliğini araştırmamıza olanak sağladık. Bu çalışma sırasında, kas liflerinin transkriptomik ve proteomik fenotiplemesinin gücünü gösterdik ve metabolik, ribozomal ve hücresel bağlantı proteinlerini lifler arası değişkenliğin önemli kaynakları olarak tanımladık. Dahası, bu proteomik iş akışını kullanarak, tek iskelet kas liflerinde nematod miyopatisinin klinik önemini karakterize ettik ve MYH'ye dayalı olarak lif tipinden bağımsız olarak oksidatif olmayan liflere doğru koordineli bir kaymayı ortaya koyduk.
İnsan iskelet kası liflerinin heterojenliğini araştırmak için, tek iskelet kası liflerinin transkriptom ve proteom analizini mümkün kılan iki iş akışı geliştirdik (Şekil 1A ve Ek Şekil 1A). Örnek depolama ve RNA ve protein bütünlüğünün korunmasından her yaklaşım için verimliliğin optimize edilmesine kadar çeşitli metodolojik adımları geliştirdik ve optimize ettik. Transkriptom analizi için bu, ters transkripsiyonun ilk adımında örneğe özgü moleküler barkodların eklenmesiyle sağlandı ve bu sayede 96 lifin verimli bir şekilde sonraki işlemler için bir araya getirilmesi mümkün oldu. Geleneksel tek hücreli yaklaşımlara kıyasla daha derin dizileme (lif başına ±1 milyon okuma), transkriptom verilerini daha da zenginleştirdi. 21 Proteomik için, yüksek verimliliği korurken proteom derinliğini optimize etmek amacıyla, timsTOF kütle spektrometresinde DIA-PASEF veri alımıyla birleştirilmiş kısa bir kromatografik gradyan (21 dakika) kullandık. 22,23 Sağlıklı iskelet kası liflerinin heterojenliğini araştırmak için, 14 sağlıklı yetişkin donörden 1.050 bireysel lifin transkriptomlarını ve 5 sağlıklı yetişkin donörden 1.038 lifin proteomlarını karakterize ettik (Ek Tablo 1). Bu makalede, bu veri setlerine sırasıyla 1.000 lif transkriptomu ve proteomu olarak atıfta bulunulmaktadır. Yaklaşımımız, 1.000 lif transkriptomu ve proteom analizlerinde toplam 27.237 transkript ve 2.983 protein tespit etti (Şekil 1A, Ek Veri Setleri 1–2). Transkriptomu ve proteom veri setlerini >1.000 tespit edilen gen ve lif başına %50 geçerli değer için filtreledikten sonra, sırasıyla transkriptomda 925 ve proteomda 974 lif için sonraki biyoinformatik analizleri gerçekleştirildi. Filtrelemeden sonra, lif başına ortalama 4257 ± 1557 gen ve 2015 ± 234 protein (ortalama ± standart sapma) tespit edildi ve bireyler arası değişkenlik sınırlıydı (Ek Şekiller 1B–C, Ek Veri Setleri 3–4). Bununla birlikte, katılımcılar arasında denek içi değişkenlik daha belirgindi; bu durum muhtemelen farklı uzunluk ve kesit alanlarına sahip lifler arasındaki RNA/protein verimindeki farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Çoğu protein için (>2000), varyasyon katsayısı %20'nin altındaydı (Ek Şekil 1D). Her iki yöntem de, kas kasılması için önemli olan yüksek düzeyde ifade edilen imzalara sahip geniş bir dinamik aralıktaki transkript ve proteinleri yakalamaya olanak sağladı (örneğin, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Ek Şekiller 1E–F). Tanımlanan özelliklerin çoğu transkriptomik ve proteomik veri kümeleri arasında ortaktı (Ek Şekil 1G) ve bu özelliklerin ortalama UMI/LFQ yoğunlukları oldukça iyi bir şekilde korelasyon gösterdi (r = 0,52) (Ek Şekil 1H).
Transkriptomik ve proteomik iş akışı (BioRender.com ile oluşturulmuştur). BD MYH7, MYH2 ve MYH1 için dinamik aralık eğrileri ve lif tipi ataması için hesaplanan eşikler. E, F Transkriptomik ve proteomik veri setlerinde lifler boyunca MYH ekspresyonunun dağılımı. G, H MYH tabanlı lif tipine göre renklendirilmiş transkriptomik ve proteomik için Tekdüze Çeşitlilik Yaklaşımı ve Projeksiyon (UMAP) grafikleri. I, J Transkriptomik ve proteomik veri setlerinde MYH7, MYH2 ve MYH1 ekspresyonunu gösteren özellik grafikleri.
Başlangıçta, omik veri kümelerindeki MYH ekspresyonunun yüksek hassasiyetinden ve dinamik aralığından yararlanan optimize edilmiş bir yaklaşım kullanarak her bir life MYH tabanlı lif tipi atamayı hedefledik. Önceki çalışmalar, farklı MYH'lerin ekspresyonunun sabit bir yüzdesine dayanarak lifleri saf tip 1, tip 2A, tip 2X veya karışık olarak etiketlemek için keyfi eşikler kullanmıştır11,14,24. Biz ise farklı bir yaklaşım kullandık; bu yaklaşımda her bir lifin ekspresyonu, lifleri tiplendirmek için kullandığımız MYH'lere göre sıralandı: sırasıyla tip 1, tip 2A ve tip 2X liflerine karşılık gelen MYH7, MYH2 ve MYH1. Daha sonra, ortaya çıkan her eğrinin alt bükülme noktasını matematiksel olarak hesapladık ve bunu her bir MYH için lifleri pozitif (eşik değerinin üstünde) veya negatif (eşik değerinin altında) olarak atamak için bir eşik olarak kullandık (Şekil 1B–D). Bu veriler, MYH7 (Şekil 1B) ve MYH2'nin (Şekil 1C) protein seviyesine kıyasla RNA seviyesinde daha belirgin açma/kapama ifade profillerine sahip olduğunu göstermektedir. Gerçekten de, protein seviyesinde, çok az lif MYH7'yi ifade etmemiştir ve hiçbir lif %100 MYH2 ifadesine sahip olmamıştır. Daha sonra, her veri kümesindeki tüm liflere MYH tabanlı lif tiplerini atamak için önceden belirlenmiş ifade eşiklerini kullandık. Örneğin, MYH7+/MYH2-/MYH1- lifleri tip 1'e atanırken, MYH7-/MYH2+/MYH1+ lifleri karışık tip 2A/2X'e atanmıştır (tam açıklama için Ek Tablo 2'ye bakınız). Tüm lifleri bir araya getirdiğimizde, hem RNA (Şekil 1E) hem de protein (Şekil 1F) seviyelerinde MYH bazlı lif tiplerinin oldukça benzer bir dağılımını gözlemledik; ancak MYH bazlı lif tiplerinin göreceli bileşimi, beklendiği gibi bireyler arasında farklılık gösterdi (Ek Şekil 2A). Liflerin çoğu ya saf tip 1 (%34-35) ya da tip 2A (%36-38) olarak sınıflandırıldı, ancak önemli sayıda karışık tip 2A/2X lifi de tespit edildi (%16-19). Dikkat çekici bir fark, saf tip 2X liflerinin yalnızca RNA seviyesinde tespit edilebilmesi, protein seviyesinde ise tespit edilememesidir; bu da hızlı MYH ekspresyonunun en azından kısmen transkripsiyon sonrası düzenlendiğini düşündürmektedir.
Proteomik tabanlı MYH lif tiplendirme yöntemimizi antikor tabanlı nokta lekeleme yöntemiyle doğruladık ve her iki yöntem de saf tip 1 ve tip 2A liflerini tanımlamada %100 uyum sağladı (Ek Şekil 2B'ye bakınız). Bununla birlikte, proteomik tabanlı yaklaşım daha hassas, karışık lifleri tanımlamada ve her bir lifte bulunan her bir MYH geninin oranını nicelendirmede daha verimliydi. Bu veriler, iskelet kası lif tiplerini karakterize etmek için objektif, son derece hassas bir omik tabanlı yaklaşımın etkinliğini göstermektedir.
Daha sonra, transkriptomik ve proteomik verilerden elde edilen birleşik bilgileri kullanarak, miyofiberleri tam transkriptom veya proteomlarına göre objektif olarak sınıflandırdık. Boyutluluğu altı temel bileşene indirgemek için tekdüze manifold yaklaşımı ve projeksiyon (UMAP) yöntemini kullanarak (Ek Şekiller 3A–B), transkriptomda (Şekil 1G) ve proteomda (Şekil 1H) miyofiber değişkenliğini görselleştirebildik. Dikkat çekici bir şekilde, miyofiberler ne transkriptomik ne de proteomik veri setlerinde katılımcılara (Ek Şekiller 3C–D) veya test günlerine (Ek Şekil 3E) göre gruplandırılmamıştır; bu da iskelet kası liflerindeki denek içi değişkenliğin denekler arası değişkenlikten daha yüksek olduğunu göstermektedir. UMAP grafiğinde, "hızlı" ve "yavaş" miyofiberleri temsil eden iki ayrı küme ortaya çıkmıştır (Şekiller 1G–H). MYH7+ (yavaş) miyofiberler UMAP1'in pozitif kutbunda kümelenirken, MYH2+ ve MYH1+ (hızlı) miyofiberler UMAP1'in negatif kutbunda kümelenmiştir (Şekil 1I–J). Bununla birlikte, MYH ekspresyonuna göre hızlı kas lifi tipleri (yani, tip 2A, tip 2X veya karışık 2A/2X) arasında bir ayrım yapılmamıştır; bu da MYH1 (Şekil 1I–J) veya ACTN3 veya MYLK2 (Ek Şekiller 4A–B) gibi diğer klasik 2X miyofiber belirteçlerinin ekspresyonunun, tüm transkriptom veya proteom dikkate alındığında farklı miyofiber tipleri arasında ayrım yapmadığını göstermektedir. Dahası, MYH2 ve MYH7 ile karşılaştırıldığında, MYH1 ile pozitif korelasyon gösteren transkript veya protein sayısı azdır (Ek Şekiller 4C–H), bu da MYH1 bolluğunun miyofiber transkriptom/proteomunu tam olarak yansıtmadığını göstermektedir. Üç MYH izoformunun UMAP düzeyinde karışık ekspresyonunu değerlendirirken de benzer sonuçlara ulaşıldı (Ek Şekiller 4I–J). Bu nedenle, 2X lifleri yalnızca MYH kantifikasyonuna dayanarak transkript düzeyinde tanımlanabilirken, MYH1+ lifleri tüm transkriptom veya proteom dikkate alındığında diğer hızlı liflerden ayırt edilemez.
MYH'nin ötesinde yavaş lif heterojenliğinin ilk keşfi olarak, dört bilinen yavaş lif tipi özgül proteinini değerlendirdik: TPM3, TNNT1, MYL3 ve ATP2A22. Yavaş lif alt tipleri, hem transkriptomik (Ek Şekil 5A) hem de proteomik (Ek Şekil 5B) analizlerde MYH7 ile yüksek, ancak mükemmel olmayan Pearson korelasyonları gösterdi. Yavaş liflerin yaklaşık %25'i ve %33'ü, transkriptomik (Ek Şekil 5C) ve proteomik (Ek Şekil 5D) analizlerde tüm gen/protein alt tipleri tarafından saf yavaş lif olarak sınıflandırılmadı. Bu nedenle, birden fazla gen/protein alt tipine dayalı yavaş lif sınıflandırması, lif tipi özgüllüğü bilinen proteinler için bile ek karmaşıklık getirir. Bu, tek bir gen/protein ailesinin izoformlarına dayalı lif sınıflandırmasının, iskelet kası liflerinin gerçek heterojenliğini yeterince yansıtmayabileceğini düşündürmektedir.
İnsan iskelet kası liflerinin fenotipik değişkenliğini tüm omik model ölçeğinde daha ayrıntılı olarak incelemek için, temel bileşen analizi (PCA) kullanarak verilerin tarafsız boyut indirgemesini gerçekleştirdik (Şekil 2A). UMAP grafiklerine benzer şekilde, ne katılımcı ne de test günü PCA düzeyinde lif kümelenmesini etkilemedi (Ek Şekiller 6A–C). Her iki veri setinde de, MYH tabanlı lif tipi, yavaş kasılan tip 1 liflerden oluşan bir küme ve hızlı kasılan tip 2A, tip 2X ve karışık 2A/2X lifleri içeren ikinci bir küme gösteren PC2 tarafından açıklandı (Şekil 2A). Her iki veri setinde de, bu iki küme az sayıda karışık tip 1/2A lifi ile birbirine bağlandı. Beklendiği gibi, ana PC sürücülerinin aşırı temsil analizi, PC2'nin kasılma ve metabolik imzalar tarafından yönlendirildiğini doğruladı (Şekil 2B ve Ek Şekiller 6D–E, Ek Veri Setleri 5–6). Genel olarak, MYH tabanlı lif tipinin, hızlı küme içindeki transkriptomda dağılmış olan sözde 2X lifler hariç, PC2 boyunca sürekli varyasyonu açıklamak için yeterli olduğu bulundu.
A. MYH'ye göre lif tipine göre renklendirilmiş transkriptom ve proteom veri kümelerinin temel bileşen analizi (PCA) grafikleri. B. PC2 ve PC1'deki transkript ve protein sürücülerinin zenginleştirme analizi. İstatistiksel analiz, clusterProfiler paketi ve Benjamini-Hochberg ayarlanmış p-değerleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. C, D. Transkriptomda hücreler arası yapışma geni ontolojisi (GO) terimlerine ve proteomda kostamer GO terimlerine göre renklendirilmiş PCA grafikleri. Oklar, transkript ve protein sürücülerini ve yönlerini temsil eder. E, F. Yavaş/hızlı lif tipinden bağımsız ifade gradyanlarını gösteren klinik olarak ilgili özelliklerin tekdüze manifold yaklaşımı ve projeksiyonu (UMAP) özellik grafikleri. G, H. Transkriptom ve proteomlardaki PC2 ve PC1 sürücüleri arasındaki korelasyonlar.
Beklenmedik bir şekilde, MYH temelli miyofiber tipi, değişkenliğin yalnızca ikinci en yüksek derecesini (PC2) açıklamıştır; bu da MYH temelli miyofiber tipiyle ilgisi olmayan diğer biyolojik faktörlerin (PC1) iskelet kası lifi heterojenliğinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığını düşündürmektedir. PC1'deki en önemli etkenlerin aşırı temsil analizi, PC1'deki değişkenliğin öncelikle transkriptomda hücreler arası yapışma ve ribozom içeriği ile proteomda kostamerler ve ribozomal proteinler tarafından belirlendiğini ortaya koymuştur (Şekil 2B ve Ek Şekiller 6D–E, Ek Veri Seti 7). İskelet kasında, kostamerler Z diskini sarkolemmaya bağlar ve kuvvet iletimi ve sinyallemede rol oynar. Hücreler arası yapışma (transkriptom, Şekil 2C) ve kostamer (proteom, Şekil 2D) özelliklerini kullanan 25 açıklamalı PCA grafiği, PC1'de güçlü bir sola kaymayı ortaya koymuştur; bu da bu özelliklerin belirli liflerde zenginleştiğini göstermektedir.
UMAP düzeyinde miyofiber kümelenmesinin daha ayrıntılı incelenmesi, özelliklerin çoğunun miyofiber alt kümesine özgü olmaktan ziyade, miyofiber tipinden bağımsız MYH tabanlı bir ekspresyon gradyanı sergilediğini ortaya koymuştur. Bu süreklilik, CHCHD10 (nöromüsküler hastalık), SLIT3 (kas atrofisi), CTDNEP1 (kas hastalığı) gibi patolojik durumlarla ilişkili çeşitli genler için gözlemlenmiştir (Şekil 2E). Bu süreklilik, nörolojik bozukluklarla (UGDH), insülin sinyallemesiyle (PHIP) ve transkripsiyonla (HIST1H2AB) ilişkili proteinler de dahil olmak üzere proteom genelinde de gözlemlenmiştir (Şekil 2F). Toplu olarak, bu veriler, farklı miyofiberler arasında lif tipinden bağımsız yavaş/hızlı kasılma heterojenliğinde sürekliliğe işaret etmektedir.
İlginç bir şekilde, PC2'deki sürücü genler iyi bir transkriptom-proteom korelasyonu gösterdi (r = 0,663) (Şekil 2G), bu da yavaş ve hızlı kas lifi tiplerinin ve özellikle iskelet kası liflerinin kasılma ve metabolik özelliklerinin transkripsiyonel olarak düzenlendiğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, PC1'deki sürücü genler transkriptom-proteom korelasyonu göstermedi (r = -0,027) (Şekil 2H), bu da yavaş/hızlı kas lifi tipleriyle ilgili olmayan varyasyonların büyük ölçüde transkripsiyon sonrası düzenlendiğini düşündürmektedir. PC1'deki varyasyonlar öncelikle ribozomal gen ontolojisi terimleriyle açıklandığı ve ribozomların hücrede protein çevirisine aktif olarak katılarak ve etkileyerek önemli ve özel bir rol oynadığı göz önüne alındığında,31 bu beklenmedik ribozomal heterojenliği araştırmaya başladık.
Proteomik ana bileşen analizi grafiğini ilk olarak GOCC terimi olan “sitoplazmik ribozom”daki proteinlerin göreceli bolluğuna göre renklendirdik (Şekil 3A). Bu terim PC1'in pozitif tarafında zenginleşmiş olsa da, küçük bir gradyanla sonuçlanmasına rağmen, ribozomal proteinler PC1'in her iki yönünde de bölümlenmeyi yönlendirmektedir (Şekil 3A). PC1'in negatif tarafında zenginleşmiş ribozomal proteinler arasında RPL18, RPS18 ve RPS13 yer alırken (Şekil 3B), PC1'in pozitif tarafındaki ana yönlendiriciler RPL31, RPL35 ve RPL38 idi (Şekil 3C). İlginç bir şekilde, RPL38 ve RPS13, diğer dokulara kıyasla iskelet kasında yüksek oranda ifade edilmiştir (Ek Şekil 7A). PC1'deki bu belirgin ribozomal imzalar transkriptomda gözlenmemiştir (Ek Şekil 7B), bu da transkripsiyon sonrası düzenlemeyi göstermektedir.
A. Proteom genelinde sitoplazmik ribozomal gen ontolojisi (GO) terimlerine göre renklendirilmiş temel bileşen analizi (PCA) grafiği. Oklar, PCA grafiğinde protein aracılı varyasyonun yönünü göstermektedir. Çizgi uzunluğu, belirli bir protein için temel bileşen puanına karşılık gelir. B, C. RPS13 ve RPL38 için PCA özellik grafikleri. D. Sitoplazmik ribozomal proteinlerin denetimsiz hiyerarşik kümeleme analizi. E. İskelet kası liflerinde farklı bollukta bulunan ribozomal proteinleri vurgulayan 80S ribozomun yapısal modeli (PDB: 4V6X). F. mRNA çıkış kanalı yakınında lokalize olmuş farklı stokiyometriye sahip ribozomal proteinler.
Ribozomal heterojenite ve özelleşme kavramları daha önce öne sürülmüştür; buna göre farklı ribozom alt popülasyonlarının varlığı (ribozomal heterojenite), belirli mRNA transkript havuzlarının seçici çevirisi yoluyla farklı dokularda32 ve hücrelerde33 protein çevirisini doğrudan etkileyebilir (ribozom özelleşmesi). İskelet kası liflerinde birlikte ifade edilen ribozomal protein alt popülasyonlarını belirlemek için, proteomdaki ribozomal proteinlerin denetimsiz hiyerarşik kümeleme analizini gerçekleştirdik (Şekil 3D, Ek Veri Seti 8). Beklendiği gibi, ribozomal proteinler MYH'ye göre lif tipine göre kümelenmedi. Bununla birlikte, üç farklı ribozomal protein kümesi belirledik; birinci küme (ribosomal_cluster_1), RPL38 ile birlikte düzenlenir ve bu nedenle pozitif PC1 profiline sahip liflerde artmış ifadeye sahiptir. İkinci küme (ribosomal_cluster_2), RPS13 ile birlikte düzenlenir ve negatif PC1 profiline sahip liflerde yükselir. Üçüncü küme (ribosomal_cluster_3), iskelet kası liflerinde koordineli diferansiyel ekspresyon göstermemektedir ve “çekirdek” iskelet kası ribozomal proteini olarak kabul edilebilir. Hem ribozomal küme 1 hem de 2, daha önce alternatif translasyonu düzenlediği (örneğin, RPL10A, RPL38, RPS19 ve RPS25) ve fonksiyonel olarak gelişimi etkilediği (örneğin, RPL10A, RPL38) gösterilen ribozomal proteinler içermektedir.34,35,36,37,38 PCA sonuçlarıyla tutarlı olarak, bu ribozomal proteinlerin lifler boyunca gözlemlenen heterojen temsili de süreklilik göstermiştir (Ek Şekil 7C).
Heterojen ribozomal proteinlerin ribozom içindeki konumunu görselleştirmek için, insan 80S ribozomunun yapısal bir modelini kullandık (Protein Veri Bankası: 4V6X) (Şekil 3E). Farklı ribozomal kümelere ait ribozomal proteinleri izole ettikten sonra, konumları yakından hizalanmamıştı; bu da yaklaşımımızın ribozomun belirli bölgeleri/kesirleri için zenginleştirme sağlamada başarısız olduğunu düşündürmektedir. Bununla birlikte, ilginç bir şekilde, küme 2'deki büyük alt birim proteinlerinin oranı, küme 1 ve 3'tekinden daha düşüktü (Ek Şekil 7D). İskelet kası liflerinde değişmiş stokiyometriye sahip proteinlerin, farklı mRNA popülasyonlarındaki iç ribozom giriş bölgesi (IRES) elemanlarıyla etkileşime girme ve böylece seçici çeviriyi koordine etme yetenekleriyle tutarlı olarak, ağırlıklı olarak ribozom yüzeyinde lokalize olduğunu gözlemledik (Şekil 3E). 40, 41 Dahası, iskelet kası liflerinde stokiyometrisi değişmiş birçok protein, belirli peptitlerin translasyonel uzamasını ve durdurulmasını seçici olarak düzenleyen mRNA çıkış tüneli gibi fonksiyonel bölgelerin yakınında yer almaktadır (Şekil 3F). 42 Özetle, verilerimiz iskelet kası ribozomal proteinlerinin stokiyometrisinin heterojenlik gösterdiğini ve bunun da iskelet kası lifleri arasında farklılıklara yol açtığını göstermektedir.
Daha sonra, hızlı ve yavaş kas lifi imzalarını belirlemeye ve transkripsiyonel düzenlemelerinin mekanizmalarını araştırmaya koyulduk. İki veri setinde UMAP tarafından tanımlanan hızlı ve yavaş kas lifi kümelerini karşılaştırarak (Şekil 1G–H ve 4A–B), transkriptomik ve proteomik analizler sırasıyla 1366 ve 804 farklı bollukta özellik belirledi (Şekil 4A–B, Ek Veri Setleri 9–12). Sarkomerlerle (örneğin, tropomiyozin ve troponin), uyarım-kasılma eşleşmesiyle (SERCA izoformları) ve enerji metabolizmasıyla (örneğin, ALDOA ve CKB) ilgili imzalarda beklenen farklılıkları gözlemledik. Dahası, protein ubikitinasyonunu düzenleyen transkriptler ve proteinler, hızlı ve yavaş kas liflerinde farklı şekilde ifade edildi (örneğin, USP54, SH3RF2, USP28 ve USP48) (Şekil 4A–B). Ayrıca, daha önce kuzu kas lifi tiplerinde farklı şekilde ifade edildiği gösterilen43 ve kalp kasında SERCA aktivitesini artıran44 mikrobiyal protein geni RP11-451G4.2 (DWORF), yavaş iskelet kası liflerinde önemli ölçüde yukarı regüle edildi (Şekil 4A). Benzer şekilde, bireysel lif düzeyinde, metabolizma ile ilgili laktat dehidrojenaz izoformları (LDHA ve LDHB, Şekil 4C ve Ek Şekil 8A)45,46 gibi bilinen imzaların yanı sıra daha önce bilinmeyen lif tipine özgü imzalar (IRX3, USP54, USP28 ve DPYSL3 gibi) arasında da önemli farklılıklar gözlemlendi (Şekil 4C). Transkriptomik ve proteomik veri kümeleri arasında farklı şekilde ifade edilen özelliklerin önemli bir örtüşmesi vardı (Ek Şekil 8B), ayrıca esas olarak sarkomer özelliklerinin daha belirgin farklı ifadesinden kaynaklanan bir kat değişim korelasyonu da mevcuttu (Ek Şekil 8C). Özellikle, bazı imzalar (örneğin USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) yalnızca proteomik düzeyde güçlü transkripsiyon sonrası düzenleme gösterdi ve yavaş/hızlı kas lifi tipine özgü ifade profillerine sahipti (Ek Şekil 8C).
A ve B volkan grafikleri, Şekil 1G–H'deki tekdüze manifold yaklaşımı ve projeksiyon (UMAP) grafikleriyle tanımlanan yavaş ve hızlı kümeleri karşılaştırmaktadır. Renkli noktalar, FDR < 0,05'te anlamlı derecede farklı olan transkriptleri veya proteinleri, daha koyu noktalar ise log değişimi > 1'de anlamlı derecede farklı olan transkriptleri veya proteinleri temsil etmektedir. İki yönlü istatistiksel analiz, Benjamini-Hochberg ayarlanmış p değerleri ile DESeq2 Wald testi (transkriptomik) veya çoklu karşılaştırmalar için Benjamini-Hochberg ayarlaması ile ampirik Bayes analizini takiben Limma doğrusal model yöntemi (proteomik) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. C Yavaş ve hızlı lifler arasında seçilen farklı ifade edilen genlerin veya proteinlerin imza grafikleri. D Anlamlı derecede farklı ifade edilen transkriptlerin ve proteinlerin zenginleştirme analizi. Örtüşen değerler her iki veri kümesinde de zenginleştirilmiştir, transkriptom değerleri yalnızca transkriptomda, proteom değerleri ise yalnızca proteomda zenginleştirilmiştir. İstatistiksel analiz, Benjamini-Hochberg düzeltilmiş p-değerleri ile clusterProfiler paketi kullanılarak gerçekleştirildi. E. SCENIC tarafından türetilen düzenleyici özgüllük puanlarına ve lif tipleri arasındaki farklı mRNA ekspresyonuna dayanarak SCENIC tarafından tanımlanan lif tipi özgül transkripsiyon faktörleri. F. Yavaş ve hızlı lifler arasında farklı şekilde ifade edilen seçilmiş transkripsiyon faktörlerinin profillenmesi.
Daha sonra, farklı şekilde temsil edilen genler ve proteinler için bir aşırı temsil analizi gerçekleştirdik (Şekil 4D, Ek Veri Seti 13). İki veri seti arasında farklılık gösteren özellikler için yol zenginleştirmesi, yağ asidi β-oksidasyonu ve keton metabolizması süreçleri (yavaş lifler), miyofilament/kas kasılması (sırasıyla hızlı ve yavaş lifler) ve karbonhidrat katabolik süreçleri (hızlı lifler) gibi beklenen farklılıkları ortaya çıkardı. Serin/treonin protein fosfataz aktivitesi de hızlı liflerde artmıştı; bu artış, glikojen metabolizmasını düzenlediği bilinen düzenleyici ve katalitik fosfataz alt birimleri (PPP3CB, PPP1R3D ve PPP1R3A) gibi özellikler tarafından yönlendiriliyordu (47) (Ek Şekiller 8D–E). Hızlı liflerde zenginleştirilmiş diğer yollar arasında, proteomda (Ek Şekil 8F) transkripsiyon sonrası düzenlemede potansiyel olarak rol oynayan (48) işleme (P-) cisimleri (YTHDF3, TRIM21, LSM2) ve transkriptomda (Ek Şekil 8G) transkripsiyon faktörü aktivitesi (SREBF1, RXRG, RORA) yer almaktadır. Yavaş lifler ise oksidoredüktaz aktivitesi (BDH1, DCXR, TXN2) (Ek Şekil 8H), amid bağlanması (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Ek Şekil 8I), hücre dışı matris (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Ek Şekil 8J) ve reseptör-ligand aktivitesi (FNDC5, SPX, NENF) (Ek Şekil 8K) açısından zenginleştirilmiştir.
Yavaş/hızlı kas lifi tipi özelliklerinin altında yatan transkripsiyonel düzenlemeye ilişkin daha fazla bilgi edinmek için, SCENIC49 (Ek Veri Seti 14) kullanarak transkripsiyon faktörü zenginleştirme analizi gerçekleştirdik. Birçok transkripsiyon faktörü, hızlı ve yavaş kas lifleri arasında önemli ölçüde zenginleşmişti (Şekil 4E). Bu, daha önce hızlı kas lifi gelişimiyle ilişkilendirilmiş olan MAFA gibi transkripsiyon faktörlerinin yanı sıra, daha önce kas lifi tipine özgü gen programlarıyla ilişkilendirilmemiş birkaç transkripsiyon faktörünü de içeriyordu. Bunlar arasında, PITX1, EGR1 ve MYF6, hızlı kas liflerinde en çok zenginleşmiş transkripsiyon faktörleriydi (Şekil 4E). Buna karşılık, ZSCAN30 ve EPAS1 (HIF2A olarak da bilinir), yavaş kas liflerinde en çok zenginleşmiş transkripsiyon faktörleriydi (Şekil 4E). Buna paralel olarak, MAFA, hızlı kas liflerine karşılık gelen UMAP bölgesinde daha yüksek seviyelerde ifade edilirken, EPAS1'in bunun tersi bir ifade modeli vardı (Şekil 4F).
Bilinen protein kodlayan genlere ek olarak, insan gelişimi ve hastalıklarının düzenlenmesinde rol oynayabilecek çok sayıda kodlayıcı olmayan RNA biyotipi bulunmaktadır. 51, 52 Transkriptom veri setlerinde, LINC01405 de dahil olmak üzere, yavaş liflere son derece özgü olan ve mitokondriyal miyopati hastalarının kaslarında azaldığı bildirilen birkaç kodlayıcı olmayan RNA, lif tipi özgüllüğü sergilemektedir (Şekil 5A ve Ek Veri Seti 15). 53 Buna karşılık, lnc-ERCC5-5 genine karşılık gelen RP11-255P5.3 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, hızlı lif tipi özgüllüğü sergilemektedir. Hem LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) hem de RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) iskelet kasına özgüllük göstermektedir (Ek Şekiller 9A–B) ve 1 Mb'lık genomik çevrelerinde bilinen hiçbir kasılma geni bulunmamaktadır; bu da komşu kasılma genlerini düzenlemek yerine lif tiplerini düzenlemede özel bir rol oynadıklarını düşündürmektedir. LINC01405 ve RP11-255P5.3'ün yavaş/hızlı lif tipi özgüllük profilleri, RNAscope kullanılarak doğrulanmıştır (Şekiller 5B–C).
A. Kodlayıcı olmayan RNA transkriptleri, yavaş ve hızlı kas liflerinde önemli ölçüde düzenlenir. B. Sırasıyla LINC01405 ve RP11-255P5.3'ün yavaş ve hızlı kas lifi tipi özgüllüğünü gösteren temsili RNAscope görüntüleri. Ölçek çubuğu = 50 μm. C. RNAscope ile belirlenen miyofiber tipine özgü kodlayıcı olmayan RNA ekspresyonunun nicelleştirilmesi (her bireyde hızlı ve yavaş kas liflerini karşılaştıran bağımsız bireylerden 3 biyopsi örneği). İstatistiksel analiz, iki kuyruklu Student's t-testi kullanılarak yapılmıştır. Kutu grafikleri medyanı ve birinci ve üçüncü çeyrekleri gösterirken, bıyıklar minimum ve maksimum değerleri işaret etmektedir. D. De novo mikrobiyal protein tanımlama iş akışı (BioRender.com ile oluşturulmuştur). E. Mikrobiyal protein LINC01405_ORF408:17441:17358, özellikle yavaş iskelet kası liflerinde ifade edilmektedir (bağımsız katılımcılardan alınan 5 biyopsi örneği, her katılımcıda hızlı ve yavaş kas lifleri karşılaştırılmıştır). İstatistiksel analiz, ampirik Bayes yaklaşımıyla birleştirilmiş Limm doğrusal model yöntemi kullanılarak yapılmış, ardından p-değeri ayarlamasıyla çoklu karşılaştırmalar için Benjamini-Hochberg yöntemi uygulanmıştır. Kutu grafikleri medyanı, birinci ve üçüncü çeyrekleri göstermekte olup, bıyıklar maksimum/minimum değerleri işaret etmektedir.
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, birçok varsayımsal kodlama yapmayan transkriptin, bazıları kas fonksiyonunu düzenleyen transkribe edilmiş mikrobiyal proteinleri kodladığını göstermiştir. 44, 55 Potansiyel lif tipi özgüllüğüne sahip mikrobiyal proteinleri tanımlamak için, 1000 lif transkriptom veri setinde bulunan kodlama yapmayan transkriptlerin (n = 305) dizilerini içeren özel bir FASTA dosyası kullanarak 1000 lif proteom veri setimizi aradık (Şekil 5D). 22 farklı transkriptten 197 mikrobiyal protein tanımladık; bunların 71'i yavaş ve hızlı iskelet kası lifleri arasında farklı şekilde düzenlenmiştir (Ek Şekil 9C ve Ek Veri Seti 16). LINC01405 için üç mikrobiyal protein ürünü tanımlandı; bunlardan biri, transkriptine benzer yavaş lif özgüllüğü gösterdi (Şekil 5E ve Ek Şekil 9D). Bu nedenle, LINC01405'i yavaş iskelet kası liflerine özgü bir mikrobiyal proteini kodlayan bir gen olarak tanımladık.
Bireysel kas liflerinin büyük ölçekli proteomik karakterizasyonu için kapsamlı bir iş akışı geliştirdik ve sağlıklı durumlarda lif heterojenliğinin düzenleyicilerini belirledik. Bu iş akışını, nemalin miyopatilerinin iskelet kas lifi heterojenliğini nasıl etkilediğini anlamak için uyguladık. Nemalin miyopatileri, kas güçsüzlüğüne neden olan kalıtsal kas hastalıklarıdır ve etkilenen çocuklarda solunum güçlüğü, skolyoz ve sınırlı uzuv hareketliliği gibi çeşitli komplikasyonlarla kendini gösterir. 19,20 Tipik olarak, nemalin miyopatilerinde, aktin alfa 1 (ACTA1) gibi genlerdeki patojenik varyantlar, yavaş kasılan lif miyofiber bileşiminin baskınlığına neden olur, ancak bu etki heterojendir. Dikkat çekici bir istisna, hızlı liflerin baskın olduğu troponin T1 nemalin miyopatisidir (TNNT1). Bu nedenle, nemalin miyopatilerinde gözlemlenen iskelet kas lifi düzensizliğinin altında yatan heterojenliğin daha iyi anlaşılması, bu hastalıklar ve miyofiber tipi arasındaki karmaşık ilişkiyi çözmeye yardımcı olabilir.
Sağlıklı kontrollerle (grup başına n=3) karşılaştırıldığında, ACTA1 ve TNNT1 genlerinde mutasyon bulunan nemalin miyopati hastalarından izole edilen miyofiberlerde belirgin miyofiber atrofisi veya distrofisi gözlendi (Şekil 6A, Ek Tablo 3). Bu durum, mevcut materyalin sınırlı miktarı nedeniyle proteomik analiz için önemli teknik zorluklar yarattı. Buna rağmen, 272 iskelet miyofiberinde 2485 protein tespit edebildik. Lif başına en az 1000 protein ölçüldükten sonra, 250 lif daha sonraki biyoinformatik analizine tabi tutuldu. Filtrelemeden sonra, lif başına ortalama 1573 ± 359 protein ölçüldü (Ek Şekil 10A, Ek Veri Setleri 17–18). Özellikle, lif boyutundaki önemli azalmaya rağmen, nemalin miyopati hastası örneklerinin proteom derinliği yalnızca mütevazı bir şekilde azaldı. Dahası, bu verileri kendi FASTA dosyalarımızı (kodlama yapmayan transkriptler dahil) kullanarak işlemek, nemalin miyopati hastalarının iskelet kas liflerinde beş mikrobiyal proteini tanımlamamızı sağladı (Ek Veri Seti 19). Proteomun dinamik aralığı önemli ölçüde daha genişti ve kontrol grubundaki toplam proteinler, daha önceki 1000 lifli proteom analizinin sonuçlarıyla iyi bir korelasyon gösterdi (Ek Şekil 10B–C).
A. ACTA1 ve TNNT1 nemalin miyopatilerinde (NM) MYH'ye göre lif atrofisi veya distrofisini ve farklı lif tiplerinin baskınlığını gösteren mikroskobik görüntüler. Ölçek çubuğu = 100 μm. ACTA1 ve TNNT1 hastalarında boyamanın tekrarlanabilirliğini sağlamak için, temsili görüntüler seçilmeden önce üç hasta biyopsisi iki ila üç kez (vaka başına dört kesit) boyandı. B. Katılımcılarda MYH'ye göre lif tipi oranları. C. Nemalin miyopatili hastalarda ve kontrol grubunda iskelet kas liflerinin temel bileşen analizi (PCA) grafiği. D. Nemalin miyopatili hastalardan ve kontrol grubundan iskelet kas liflerinin, Şekil 2'de analiz edilen 1000 liften belirlenen bir PCA grafiğine yansıtılması. Örneğin, ACTA1 ve TNNT1 nemalin miyopatili katılımcılar ile kontrol grubu arasındaki ve ACTA1 ve TNNT1 nemalin miyopatili katılımcılar arasındaki farklılıkları karşılaştıran volkan grafikleri. Renkli daireler, π < 0,05 düzeyinde anlamlı farklılık gösteren proteinleri, koyu noktalar ise FDR < 0,05 düzeyinde anlamlı farklılık gösteren proteinleri göstermektedir. İstatistiksel analiz, Limma doğrusal model yöntemi ve ampirik Bayes yöntemleri kullanılarak gerçekleştirilmiş, ardından Benjamini-Hochberg yöntemi kullanılarak çoklu karşılaştırmalar için p-değeri düzeltmesi yapılmıştır. H. Tüm proteomda ve tip 1 ve 2A liflerinde anlamlı derecede farklı ifade edilen proteinlerin zenginleştirme analizi. İstatistiksel analiz, clusterProfiler paketi ve Benjamini-Hochberg düzeltilmiş p-değerleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. I, J. Ekstraselüler matris ve mitokondriyal gen ontolojisi (GO) terimlerine göre renklendirilmiş temel bileşen analizi (PCA) grafikleri.
Nemalin miyopatilerinin iskelet kasındaki MYH eksprese eden miyofiber tiplerinin oranını etkileyebildiği için,19,20 öncelikle nemalin miyopatili hastalarda ve kontrol grubunda MYH eksprese eden miyofiber tiplerini inceledik. Daha önce 1000 miyofiber deneyi için tanımlanan tarafsız bir yöntem kullanarak miyofiber tipini belirledik (Ek Şekiller 10D–E) ve yine saf 2X miyofiberleri tespit edemedik (Şekil 6B). Nemalin miyopatilerinin miyofiber tipi üzerinde heterojen bir etkisi olduğunu gözlemledik; ACTA1 mutasyonlu iki hastada tip 1 miyofiber oranı artarken, TNNT1 nemalin miyopatili iki hastada tip 1 miyofiber oranı azaldı (Şekil 6B). Gerçekten de, ACTA1-nemalin miyopatilerinde MYH2 ve hızlı troponin izoformlarının (TNNC2, TNNI2 ve TNNT3) ekspresyonu azalırken, TNNT1-nemalin miyopatilerinde MYH7 ekspresyonu azalmıştır (Ek Şekil 11A). Bu, nemalin miyopatilerinde heterojen miyofiber tip değişimine ilişkin önceki raporlarla tutarlıdır.19,20 Bu sonuçları immünohistokimya ile doğruladık ve ACTA1-nemalin miyopatisi olan hastalarda tip 1 miyofiberlerin baskın olduğunu, TNNT1-nemalin miyopatisi olan hastalarda ise bunun tersi bir durumun olduğunu bulduk (Şekil 6A).
Tek lif proteom düzeyinde, ACTA1 ve TNNT1 nemalin miyopati hastalarından alınan iskelet kası lifleri, kontrol liflerinin çoğunluğuyla kümelendi ve TNNT1 nemalin miyopati lifleri genellikle en ciddi şekilde etkilenmişti (Şekil 6C). Bu durum, her hasta için sözde şişirilmiş liflerin temel bileşen analizi (PCA) grafikleri çizildiğinde özellikle belirgindi; TNNT1 nemalin miyopati hastaları 2 ve 3, kontrol örneklerinden en uzak görünüyordu (Ek Şekil 11B, Ek Veri Seti 20). Miyopati hastalarından alınan liflerin sağlıklı liflerle nasıl karşılaştırıldığını daha iyi anlamak için, sağlıklı yetişkin katılımcılardan alınan 1000 lifin proteomik analizinden elde edilen ayrıntılı bilgileri kullandık. Miyopati veri setinden (ACTA1 ve TNNT1 nemalin miyopati hastaları ve kontroller) lifleri, 1000 liflik proteomik analizden elde edilen PCA grafiğine yansıttık (Şekil 6D). Kontrol liflerindeki PC2 boyunca MYH lif tiplerinin dağılımı, 1000 liflik proteomik analizden elde edilen lif dağılımına benzerdi. Bununla birlikte, nemalin miyopati hastalarındaki liflerin çoğu, doğal MYH lif tiplerinden bağımsız olarak, PC2 boyunca aşağı kayarak sağlıklı hızlı kasılan liflerle örtüşüyordu. Bu nedenle, ACTA1 nemalin miyopati hastaları MYH tabanlı yöntemlerle nicelendirildiğinde tip 1 liflere doğru bir kayma gösterse de, hem ACTA1 nemalin miyopati hem de TNNT1 nemalin miyopati, iskelet kası lif proteomunu hızlı kasılan liflere doğru kaydırdı.
Daha sonra her hasta grubunu sağlıklı kontrollerle doğrudan karşılaştırdık ve ACTA1 ve TNNT1 nemalin miyopatilerinde sırasıyla 256 ve 552 farklı şekilde ifade edilen protein belirledik (Şekil 6E–G ve Ek Şekil 11C, Ek Veri Seti 21). Gen zenginleştirme analizi, mitokondriyal proteinlerde koordineli bir azalmayı ortaya çıkardı (Şekil 6H–I, Ek Veri Seti 22). Şaşırtıcı bir şekilde, ACTA1 ve TNNT1 nemalin miyopatilerinde lif tiplerinin farklı baskınlığına rağmen, bu azalma MYH temelli lif tipinden tamamen bağımsızdı (Şekil 6H ve Ek Şekiller 11D–I, Ek Veri Seti 23). ACTA1 veya TNNT1 nemalin miyopatilerinde üç mikrobiyal protein de düzenlenmişti. Bu mikroproteinlerden ikisi, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (aynı zamanda LINC00598 veya Lnc-FOXO1 olarak da bilinir) ve ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), yalnızca tip 1 miyofiberlerde farklı bolluk gösterdi. ENSG00000215483_TR14_ORF67'nin daha önce hücre döngüsü düzenlemesinde rol oynadığı bildirilmiştir. 56 Öte yandan, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798'e karşılık gelir), ACTA1-nemalin miyopatisinde hem tip 1 hem de tip 2A miyofiberlerde sağlıklı kontrollere kıyasla artmıştır (Ek Şekil 12A, Ek Veri Seti 24). Buna karşılık, ribozomal proteinler nemalin miyopatisinden büyük ölçüde etkilenmedi, ancak ACTA1 nemalin miyopatisinde RPS17'nin ekspresyonu azaldı (Şekil 6E).
Zenginleştirme analizi ayrıca ACTA1 ve TNNT1 nemalin miyopatilerinde bağışıklık sistemi süreçlerinin yukarı regülasyonunu ortaya koyarken, TNNT1 nemalin miyopatisinde hücre yapışması da artmıştı (Şekil 6H). Bu hücre dışı faktörlerin zenginleşmesi, hücre dışı matris proteinlerinin PCA'yı PC1 ve PC2'de negatif yönde (yani en çok etkilenen liflere doğru) kaydırmasıyla yansıtıldı (Şekil 6J). Her iki hasta grubu da, anneksinler (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 ve etkileşimli proteinleri S100A1159 gibi bağışıklık yanıtlarında ve sarkolemmal onarım mekanizmalarında rol alan hücre dışı proteinlerin artmış ekspresyonunu gösterdi (Ek Şekiller 12B–C). Bu sürecin daha önce kas distrofilerinde arttığı bildirilmişti60, ancak bildiğimiz kadarıyla daha önce nemalin miyopatileriyle ilişkilendirilmemişti. Bu moleküler mekanizmanın normal işlevi, yaralanma sonrası sarkolemmal onarım ve yeni oluşan miyositlerin miyofiberlerle kaynaşması için gereklidir58,61. Dolayısıyla, her iki hasta grubunda da bu sürecin artan aktivitesi, miyofiber instabilitesinin neden olduğu yaralanmaya karşı onarıcı bir yanıtı düşündürmektedir.
Her bir nemalin miyopatisinin etkileri iyi bir şekilde korelasyon gösterdi (r = 0,736) ve makul bir örtüşme sergiledi (Ek Şekiller 11A–B), bu da ACTA1 ve TNNT1 nemalin miyopatisinin proteom üzerinde benzer etkilere sahip olduğunu gösteriyor. Bununla birlikte, bazı proteinler yalnızca ACTA1 veya TNNT1 nemalin miyopatisinde düzenlendi (Ek Şekiller 11A ve C). Profibrotik protein MFAP4, TNNT1 nemalin miyopatisinde en çok yukarı regüle edilen proteinlerden biriydi, ancak ACTA1 nemalin miyopatisinde değişmeden kaldı. HOX gen transkripsiyonunu düzenlemekten sorumlu PAF1C kompleksinin bir bileşeni olan SKIC8, TNNT1 nemalin miyopatisinde aşağı regüle edildi, ancak ACTA1 nemalin miyopatisinde etkilenmedi (Ek Şekil 11A). ACTA1 ve TNNT1 nemalin miyopatilerinin doğrudan karşılaştırılması, TNNT1 nemalin miyopatisinde mitokondriyal proteinlerde daha büyük azalmalar ve bağışıklık sistemi proteinlerinde artışlar olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 6G–H ve Ek Şekiller 11C ve 11H–I). Bu veriler, TNNT1 nemalin miyopatisinde gözlemlenen daha büyük atrofi/distrofi ile tutarlıdır (Şekil 6A), bu da TNNT1 nemalin miyopatisinin hastalığın daha şiddetli bir formunu temsil ettiğini düşündürmektedir.
Nemalin miyopatisinin gözlemlenen etkilerinin tüm kas düzeyinde devam edip etmediğini değerlendirmek için, aynı TNNT1 nemalin miyopati hasta kohortundan alınan kas biyopsilerinin toplu proteomik analizini gerçekleştirdik ve bunları kontrollerle karşılaştırdık (grup başına n=3) (Ek Şekil 13A, Ek Veri Seti 25). Beklendiği gibi, kontroller ana bileşen analizinde yakından ilişkiliydi, oysa TNNT1 nemalin miyopati hastaları, tek lif analizinde görülenlere benzer şekilde daha yüksek örnekler arası değişkenlik gösterdi (Ek Şekil 13B). Toplu analiz, bireysel liflerin karşılaştırılmasıyla vurgulanan farklı şekilde ifade edilen proteinleri (Ek Şekil 13C, Ek Veri Seti 26) ve biyolojik süreçleri (Ek Şekil 13D, Ek Veri Seti 27) yeniden üretti, ancak farklı lif tipleri arasında ayrım yapma yeteneğini kaybetti ve lifler arasında heterojen hastalık etkilerini hesaba katamadı.
Bu veriler bir araya getirildiğinde, tek kas lifi proteomiklerinin, immünoblotlama gibi hedefli yöntemlerle tespit edilemeyen klinik biyolojik özellikleri aydınlatabileceğini göstermektedir. Dahası, bu veriler, fenotipik adaptasyonu tanımlamak için yalnızca aktin lifi tiplendirmesinin (MYH) kullanılmasının sınırlılıklarını vurgulamaktadır. Gerçekten de, lif tipi değişimi aktin ve troponin nemalin miyopatileri arasında farklılık gösterse de, her iki nemalin miyopatisi de MYH lifi tiplendirmesini iskelet kası lifi metabolizmasından ayırarak daha hızlı ve daha az oksidatif bir kas proteomuna doğru ilerlemektedir.
Hücresel heterojenlik, dokuların çeşitli taleplerini karşılaması için kritik öneme sahiptir. İskelet kasında bu, genellikle farklı derecelerde kuvvet üretimi ve yorulabilirlik ile karakterize edilen lif tipleri olarak tanımlanır. Bununla birlikte, bunun iskelet kas lifi değişkenliğinin yalnızca küçük bir bölümünü açıkladığı açıktır; bu değişkenlik, daha önce düşünüldüğünden çok daha karmaşık ve çok yönlüdür. Teknolojik gelişmeler, iskelet kas liflerini düzenleyen faktörlere ışık tutmuştur. Nitekim, verilerimiz tip 2X liflerin ayrı bir iskelet kas lifi alt tipi olmayabileceğini göstermektedir. Dahası, metabolik proteinleri, ribozomal proteinleri ve hücreyle ilişkili proteinleri iskelet kas lifi heterojenliğinin başlıca belirleyicileri olarak tanımladık. Proteomik iş akışımızı nematod miyopatisi olan hasta örneklerine uygulayarak, MYH tabanlı lif tiplendirmesinin, özellikle sistem bozulduğunda, iskelet kas heterojenliğini tam olarak yansıtmadığını daha da gösterdik. Gerçekten de, MYH bazlı lif tipinden bağımsız olarak, nematod miyopatisi daha hızlı ve daha az oksidatif liflere doğru bir kaymaya neden olur.
İskelet kas lifleri 19. yüzyıldan beri sınıflandırılmaktadır. Son omik analizler, farklı MYH lif tiplerinin ekspresyon profillerini ve farklı uyaranlara verdikleri yanıtları anlamaya başlamamızı sağlamıştır. Burada açıklandığı gibi, omik yaklaşımlar, bir iskelet kas lifi tipini tanımlamak için tek bir (veya birkaç) belirtecin nicelendirilmesine dayanmadan, geleneksel antikor tabanlı yöntemlere göre lif tipi belirteçlerini nicelendirmede daha yüksek hassasiyet avantajına da sahiptir. İnsan iskelet kas liflerindeki lif heterojenliğinin transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası düzenlenmesini incelemek için tamamlayıcı transkriptomik ve proteomik iş akışlarını kullandık ve sonuçları entegre ettik. Bu iş akışı, sağlıklı genç erkeklerden oluşan kohortumuzun vastus lateralis kasında protein düzeyinde saf 2X tipi liflerin tanımlanamamasıyla sonuçlandı. Bu, sağlıklı vastus lateralis kasında %1'den az saf 2X lif bulan önceki tek lif çalışmalarıyla tutarlıdır, ancak bu durum gelecekte diğer kaslarda da doğrulanmalıdır. mRNA düzeyinde neredeyse tamamen saf 2X liflerin saptanması ile protein düzeyinde yalnızca karışık 2A/2X liflerin saptanması arasındaki tutarsızlık şaşırtıcıdır. MYH izoform mRNA ekspresyonu sirkadiyen değildir,67 bu da RNA düzeyinde görünüşte tamamen saf 2X liflerde MYH2 başlangıç sinyalini "kaçırmış" olma ihtimalimizin düşük olduğunu düşündürmektedir. Tamamen varsayımsal olsa da olası bir açıklama, MYH izoformları arasında protein ve/veya mRNA stabilitesindeki farklılıklar olabilir. Gerçekten de, hiçbir hızlı lif herhangi bir MYH izoformu için %100 saf değildir ve %70-90 aralığındaki MYH1 mRNA ekspresyon seviyelerinin protein düzeyinde eşit MYH1 ve MYH2 bolluğuna yol açıp açmayacağı belirsizdir. Bununla birlikte, tüm transkriptom veya proteomu dikkate alırken, kümeleme analizi, kesin MYH bileşiminden bağımsız olarak, yavaş ve hızlı iskelet kası liflerini temsil eden yalnızca iki farklı kümeyi güvenle tanımlayabilir. Bu, tipik olarak yalnızca iki farklı miyonükleer küme tanımlayan tek çekirdekli transkriptomik yaklaşımlar kullanan analizlerle tutarlıdır. 68, 69, 70 Dahası, önceki proteomik çalışmalar tip 2X liflerini tanımlamış olsa da, bu lifler hızlı liflerin geri kalanından ayrı olarak kümelenmez ve MYH'ye göre diğer lif tiplerine kıyasla yalnızca az sayıda farklı miktarda protein gösterir. 14 Bu sonuçlar, insan iskelet kası liflerini MYH'ye göre üç farklı sınıfa değil, metabolik ve kasılma özelliklerine göre iki kümeye ayıran 20. yüzyılın başlarındaki kas lifi sınıflandırma görüşüne geri dönmemiz gerektiğini düşündürmektedir. 63
Daha da önemlisi, miyofiber heterojenliği birden fazla boyutta ele alınmalıdır. Önceki “omik” çalışmalar bu yöne işaret ederek, iskelet kas liflerinin ayrı kümeler oluşturmadığını, aksine bir süreklilik boyunca düzenlendiğini öne sürmüştür. 11, 13, 14, 64, 71 Burada, iskelet kasının kasılma ve metabolik özelliklerindeki farklılıklara ek olarak, miyofiberlerin hücreler arası etkileşimler ve translasyon mekanizmalarıyla ilgili özelliklerle de farklılaştırılabileceğini gösteriyoruz. Gerçekten de, yavaş ve hızlı lif tiplerinden bağımsız olarak heterojenliğe katkıda bulunan iskelet kas liflerinde ribozom heterojenliği bulduk. Yavaş ve hızlı lif tipinden bağımsız olarak bu önemli miyofiber heterojenliğinin altında yatan neden belirsizliğini koruyor, ancak bu durum, belirli kuvvetlere ve yüklere en iyi şekilde yanıt veren kas demetleri içindeki özelleşmiş uzamsal organizasyona,72 kas mikro ortamındaki diğer hücre tipleriyle özelleşmiş hücresel veya organa özgü iletişime73,74,75 veya bireysel miyofiberler içindeki ribozom aktivitesindeki farklılıklara işaret edebilir. Gerçekten de, RPL3 ve RPL3L'nin paralog ikamesi yoluyla veya rRNA'nın 2'O-metilasyonu düzeyinde ribozomal heteroplazminin iskelet kası hipertrofisi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir76,77. Çoklu omik ve uzamsal uygulamalar, bireysel miyofiberlerin fonksiyonel karakterizasyonu ile birleştirildiğinde, kas biyolojisi hakkındaki anlayışımızı çoklu omik düzeyde daha da ilerletecektir78.
Nemalin miyopatili hastalardan alınan tek miyofiberlerin proteomlarını analiz ederek, iskelet kasının klinik patofizyolojisini aydınlatmada tek miyofiber proteomiklerinin yararlılığını, etkinliğini ve uygulanabilirliğini de gösterdik. Dahası, iş akışımızı global proteomik analizle karşılaştırarak, tek miyofiber proteomiklerinin global doku proteomikleriyle aynı bilgi derinliğini sağladığını ve lifler arası heterojenliği ve miyofiber tipini hesaba katarak bu derinliği genişlettiğini gösterebildik. ACTA1 ve TNNT1 nemalin miyopatilerinde sağlıklı kontrollere kıyasla gözlemlenen lif tipi oranındaki beklenen (ancak değişken) farklılıklara ek olarak, MYH aracılı lif tipi değişiminden bağımsız oksidatif ve hücre dışı yeniden yapılanmayı da gözlemledik. Daha önce TNNT1 nemalin miyopatilerinde fibrozis rapor edilmişti.19 Bununla birlikte, analizimiz, ACTA1 ve TNNT1 nemalin miyopatili hastalardan alınan miyofiberlerde sarkolemmal onarım mekanizmalarında rol alan anneksinler gibi hücre dışı salgılanan stresle ilgili proteinlerin artmış seviyelerini de ortaya koyarak bu bulguyu desteklemektedir.57,58,59 Sonuç olarak, nemalin miyopatili hastalardan alınan miyofiberlerdeki artmış anneksin seviyeleri, şiddetli atrofik miyofiberleri onarmaya yönelik hücresel bir yanıtı temsil edebilir.
Bu çalışma, bugüne kadar insanlarda yapılan en büyük tek lifli tüm kas-omik analizini temsil etse de, bazı sınırlamaları da bulunmaktadır. Nispeten küçük ve homojen bir katılımcı grubundan ve tek bir kastan (vastus lateralis) iskelet kası lifleri izole ettik. Bu nedenle, kas tipleri arasında ve kas fizyolojisinin uç noktalarında belirli lif popülasyonlarının varlığını dışlamak mümkün değildir. Örneğin, yüksek düzeyde antrenmanlı sprinterlerde ve/veya güç sporcularında79 veya kas aktivitesinin olmadığı dönemlerde66,80 ultra hızlı liflerin (örneğin, saf 2X lifler) bir alt kümesinin ortaya çıkma olasılığını dışlayamayız. Ayrıca, katılımcıların sınırlı örneklem büyüklüğü, lif tipi oranlarının erkekler ve kadınlar arasında farklılık gösterdiği bilindiğinden, lif heterojenliğinde cinsiyet farklılıklarını araştırmamızı engelledi. Dahası, aynı kas lifleri veya aynı katılımcılardan alınan örnekler üzerinde transkriptomik ve proteomik analizler yapamadık. Biz ve diğerleri, ultra düşük örnek girdisi elde etmek için omik analiz kullanarak tek hücreli ve tek kas lifi analizlerini optimize etmeye devam ederken (burada mitokondriyal miyopati hastalarından alınan liflerin analizinde gösterildiği gibi), tek kas lifleri içinde çoklu omik (ve fonksiyonel) yaklaşımları birleştirme fırsatı belirgin hale geliyor.
Genel olarak, verilerimiz iskelet kası heterojenliğinin transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası etkenlerini belirlemekte ve açıklamaktadır. Özellikle, iskelet kası fizyolojisinde lif tiplerinin klasik MYH tabanlı tanımıyla ilişkili uzun süredir devam eden bir dogmayı sorgulayan veriler sunuyoruz. Tartışmayı yeniden başlatmayı ve nihayetinde iskelet kası lif sınıflandırması ve heterojenliği hakkındaki anlayışımızı yeniden düşünmeyi umuyoruz.
Bu çalışmaya gönüllü olarak on dört Kafkas katılımcı (12 erkek ve 2 kadın) katıldı. Çalışma, Ghent Üniversitesi Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylandı (BC-10237), 2013 Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak yürütüldü ve ClinicalTrials.gov'da (NCT05131555) kayıt altına alındı. Katılımcıların genel özellikleri Ek Tablo 1'de sunulmuştur. Sözlü ve yazılı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra, katılımcılar çalışmaya nihai olarak dahil edilmeden önce tıbbi muayeneden geçtiler. Katılımcılar genç (22-42 yaş), sağlıklı (tıbbi rahatsızlığı olmayan, sigara geçmişi olmayan) ve orta derecede fiziksel olarak aktif kişilerdi. Maksimal oksijen alımı, daha önce açıklandığı gibi fiziksel uygunluğu değerlendirmek için bir step ergometre kullanılarak belirlendi. 81
Kas biyopsi örnekleri, 14 gün arayla üç kez, dinlenme ve açlık durumunda alındı. Bu örnekler daha büyük bir çalışmanın parçası olarak alındığından, katılımcılar biyopsiden 40 dakika önce plasebo (laktoz), bir H1 reseptör antagonisti (540 mg feksofenadin) veya bir H2 reseptör antagonisti (40 mg famotidin) tükettiler. Daha önce bu histamin reseptör antagonistlerinin dinlenme halindeki iskelet kası uygunluğunu etkilemediğini gösterdik81 ve kalite kontrol grafiklerimizde durumla ilgili kümelenme gözlenmedi (Ek Şekiller 3 ve 6). Her deney gününden 48 saat önce standart bir diyet (vücut ağırlığı başına 41,4 kcal, vücut ağırlığı başına 5,1 g karbonhidrat, vücut ağırlığı başına 1,4 g protein ve vücut ağırlığı başına 1,6 g yağ) uygulandı ve deney gününün sabahında standart bir kahvaltı (vücut ağırlığı başına 1,5 g karbonhidrat) tüketildi. Lokal anestezi altında (epinefrin içermeyen %1 lidokainin 0,5 ml'si), perkütan Bergström aspirasyonu kullanılarak vastus lateralis kasından kas biyopsileri alındı.82 Kas örnekleri hemen RNAlater'e gömüldü ve manuel lif diseksiyonuna kadar (en fazla 3 gün) 4°C'de saklandı.
Yeni izole edilmiş miyofiber demetleri, kültür kabındaki taze RNAlater ortamına aktarıldı. Daha sonra, bireysel miyofiberler stereomikroskop ve ince cımbızlar kullanılarak elle diseksiyon edildi. Her biyopsiden yirmi beş lif diseksiyon edildi ve biyopsinin farklı bölgelerinden lif seçimine özellikle dikkat edildi. Diseksiyondan sonra, her lif, istenmeyen proteinleri ve DNA'yı uzaklaştırmak için proteinaz K ve DNaz enzimleri içeren 3 μl lizis tamponuna (SingleShot Hücre Lizis Kiti, Bio-Rad) nazikçe daldırıldı. Hücre lizizi ve protein/DNA uzaklaştırılması, kısa süreli vorteksleme, sıvının mikro santrifüjde döndürülmesi ve oda sıcaklığında (10 dk) inkübasyon ile başlatıldı. Lizat daha sonra bir termal döngüleyici (T100, Bio-Rad) içinde 37°C'de 5 dakika, 75°C'de 5 dakika inkübe edildi ve daha sonra işleme kadar hemen -80°C'de saklandı.
Illumina uyumlu poliadenile edilmiş RNA kütüphaneleri, QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Kütüphane Hazırlama Kiti (Lexogen) kullanılarak 2 µl miyofiber lizatından hazırlandı. Ayrıntılı yöntemler üreticinin kılavuzunda bulunabilir. İşlem, ters transkripsiyon yoluyla birinci zincir cDNA sentezi ile başlar; bu sırada, örneklerin birleştirilmesini sağlamak ve sonraki işlemler sırasında teknik değişkenliği azaltmak için benzersiz moleküler tanımlayıcılar (UMI'ler) ve örneğe özgü i1 barkodları eklenir. Daha sonra 96 miyofiberden elde edilen cDNA birleştirilir ve manyetik boncuklarla saflaştırılır, ardından RNA uzaklaştırılır ve rastgele primerler kullanılarak ikinci zincir sentezi gerçekleştirilir. Kütüphane manyetik boncuklarla saflaştırılır, havuza özgü i5/i7 etiketleri eklenir ve PCR ile çoğaltılır. Son bir saflaştırma adımı Illumina uyumlu kütüphaneler üretir. Her kütüphane havuzunun kalitesi, Yüksek Hassasiyetli Küçük Parça DNA Analiz Kiti (Agilent Technologies, DNF-477-0500) kullanılarak değerlendirildi.
Qubit kantifikasyonuna dayanarak, havuzlar eşit molar konsantrasyonlarda (2 nM) daha da birleştirildi. Elde edilen havuz daha sonra NovaSeq S2 Reaktif Kiti (1 × 100 nükleotid) ve 2 nM yükleme (%4 PhiX) kullanılarak standart modda bir NovaSeq 6000 cihazında dizilendi.
İşlem hattımız, Lexogen'in QuantSeq Pool veri analiz işlem hattına (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) dayanmaktadır. Veriler ilk olarak i7/i5 indeksine göre bcl2fastq2 (v2.20.0) ile demultiplekslendi. Daha sonra, i1 örnek barkoduna göre idemux (v0.1.6) ile okuma 2 demultiplekslendi ve UMI dizileri umi_tools (v1.0.1) ile çıkarıldı. Okumalar daha sonra, kısa okumaları (<20 uzunluğunda) veya yalnızca adaptör dizilerinden oluşan okumaları kaldırmak için cutadapt (v3.4) ile birden fazla turda kırpıldı. Okumalar daha sonra STAR (v2.6.0c) kullanılarak insan genomuna hizalandı ve BAM dosyaları SAMtools (v1.11) ile indekslendi. Yinelenen okumalar umi_tools (v1.0.1) kullanılarak kaldırıldı. Son olarak, Subread (v2.0.3) içindeki featureCounts kullanılarak hizalama sayımı gerçekleştirildi. İşlem hattının çeşitli ara aşamalarında FastQC (v0.11.9) kullanılarak kalite kontrolü yapıldı.
Tüm biyoinformatik işleme ve görselleştirme, öncelikle Seurat (v4.4.0) iş akışı kullanılarak R (v4.2.3)'te gerçekleştirildi. 83 Bu nedenle, bireysel UMI değerleri ve meta veri matrisleri Seurat nesnelerine dönüştürüldü. Tüm liflerin %30'undan daha azında ifade edilen genler kaldırıldı. Düşük kaliteli örnekler, minimum 1000 UMI değeri ve 1000 tespit edilen gen eşiğine göre kaldırıldı. Sonuç olarak, 925 lif tüm kalite kontrol filtreleme adımlarını geçti. UMI değerleri, tüm 7418 tespit edilen özelliği içeren Seurat SCTransform v2 yöntemi 84 kullanılarak normalize edildi ve katılımcılar arası farklılıklar regresyon yoluyla çıkarıldı. İlgili tüm meta veriler Ek Veri Seti 28'de bulunabilir.
Yayın tarihi: 10 Eylül 2025